微生物的生长繁殖及其控制

第六章微生物的生长繁殖及其控制,细胞物质有规律地、不可逆地增加，导致细胞体积扩大的生物学过程。,生长：,微生物生长到一定阶段，由于细胞结构的复制与重建并通过特定方式产生新的生命个体，即引起生命个体数量增加的生物学过程。,繁殖：,微生物的生长与繁殖是两个不同但又相互联系的概念。生长是一个逐步发生的量变过程，繁殖是一个产生新的生命个体的质变过程。,在高等生物里这两个过程可以明显分开，但在低等特别是在单细胞的生物里，由于个体微小，这两个过程是紧密联系又很难划分的过程。,一个微生物细胞,合适的外界条件，吸收营养物质，进行代谢。,如果同化作用的速度超过了异化作用,个体的生长原生质的总量（重量、体积、大小）就不断增加,如果各细胞组分是按恰当的比例增长时，则达到一定程度后就会发生繁殖，引起个体数目的增加。,群体内各个个体的进一步生长,群体的生长,群体生长=个体生长+个体繁殖,个体生长个体繁殖群体生长,在一定时间和条件下细胞数量的增加（微生物群体生长）,微生物生长:,在微生物学中提到的“生长”，一般均指群体生长，这一点与研究大生物时有所不同。,第一节细菌的个体生长,细菌的个体生长包括细胞结构的复制与再生、细胞的分裂与控制。,一、染色体DNA的复制和分离,细菌的染色体为环形的双链DNA分子。染色体以双向的方式进行连续的复制，在细胞分裂之前不仅完成了染色体的复制，也开始了两个子细胞DNA分子的复制。,复制起点附着在细胞膜上，随着膜的生长和细胞分裂，两个未来的子细胞基因组不断地分离开来，最后到达子细胞中。,二、细胞壁扩增,杆菌在生长过程中，新合成的肽聚糖在细胞壁中是新老细胞壁呈间隔分布，新合成的肽聚糖在多个位点插入。,球菌在生长过程中，新合成的肽聚糖是固定在赤道板附近插入，导致新老细胞壁能明显地分开，原来的细胞壁被推向两端。,第二节细菌的群体生长繁殖,微生物的特点：,个体微小,肉眼看到或接触到的微生物是成千上万个单个的微生物组成的群体。,微生物接种是群体接种，接种后的生长是微生物群体繁殖生长。,对细菌群体生长规律的了解是对其进行研究与利用的基础,第二节细菌的群体生长繁殖,一、生长的规律,生长曲线(GrowthCurve)：,细菌接种到定量的液体培养基中，定时取样测定细胞数量，以培养时间为横座标，以菌数为纵座标作图，得到的一条反映细菌在整个培养期间菌数变化规律的曲线。,在微生物学中提到的“生长”，均指群体生长。,第二节细菌的群体生长繁殖,一、生长的规律,细菌的生长曲线一般用菌数的对数为纵坐标作图,第二节细菌的群体生长繁殖,一、生长的规律,一条典型的生长曲线可以分为：迟缓期，对数生长期，稳定生长期和衰亡期4个生长时期,第二节细菌的群体生长繁殖,一、生长的规律,迟缓期(Lagphase)：,将少量菌种接入新鲜培养基后，在开始一段时间内菌数不立即增加，或增加很少，生长速度接近于零。,迟缓期的特点：,分裂迟缓、代谢活跃,细胞形态变大或增长，例如巨大芽孢杆菌，在迟缓期末，细胞的平均长度比刚接种时长6倍。一般来说处于迟缓期的细菌细胞体积最大胞内贮藏物质逐渐消耗；细胞内DNA和RNA，尤其是rRNA含量增高，合成代谢活跃，核糖体、酶类和ATP的合成加快，易产生诱导酶。对外界不良条件反应敏感。,细胞处于活跃生长中，只是分裂迟缓在此阶段后期，少数细胞开始分裂，曲线略有上升。,迟缓期出现的原因：,微生物接种到一个新的环境，暂时缺乏足够的能量和必需的生长因子，需要一段时间的调整和适应；菌种老化或未充分活化；接种时造成的损伤等。,调整代谢,迟缓期是必需的，因为细胞分裂之前，细胞各成分的复制与装配等也需要时间。,在生产实践中缩短迟缓期的常用手段：,(1)通过遗传学方法改变菌种的遗传特性使迟缓期缩短；,(2)利用对数生长期的细胞作为“种子”；,(3)尽量使接种前后所使用的培养基组成不要相差太大；,(4)适当扩大接种量,第二节细菌的群体生长繁殖,一、生长的规律,对数生长期(Logphase)：,以最大的速率生长和分裂，导致细菌数量呈对数增加，细菌内各成分按比例有规律地增加，表现为平衡生长。所有细胞组分呈彼此相对稳定速度合成。细菌的代谢活性及酶活性高而稳定，细胞大小比较一致，生活力强，在生产上常被广泛地用作“种子”。,t1t0G=3.322(logNtlogN0),代时(Generationtime):在细菌个体生长里，每个细菌分裂繁殖一代所需的时间。通常以G表示。倍增时间（Doublingtime)：在群体生长里细菌数量增加一倍所需的时间。,=3.322(logNtlogN0),利用n和t的概念，可用于计算在不同培养条件下不同微生物的G，是研究微生物生长动力学的重要参数。,Nt=N02n,logNt=logN0+n.log2n=logNt-logN0/log2=logNt-logN0/0.301,纳米细菌（nanobacteria），3天才分裂1次；90年代初期人们从地下数公里发现的超微型细菌，用代谢产生的CO2作指标，计算出这些超微型细菌的代谢速率仅为地上正常细菌的10-15，有人认为它们需要100年才能分裂1次。,某些微生物的生长代时,影响微生物增代时间（代时）的因素：,1）菌种，不同的微生物及微生物的不同菌株代时不同；,2）营养成分，在营养丰富的培养基中生长代时短,3）营养物浓度，生长速率与营养物浓度呈正比，,凡是处于较低浓度范围内，可影响生长速率的营养物成分，就称为生长限制因子。,4）温度，在一定范围，生长速率与培养温度呈正相关。,第二节细菌的群体生长繁殖,一、生长曲线,稳定生长期(Stationaryphase)：,由于营养物质消耗，代谢产物积累和pH等环境变化，环境条件逐步不适宜于细菌生长，导致细菌生长速率降低直至零(即细菌分裂增加的数量等于细菌死亡数)。,稳定生长期的活细菌数最高并维持稳定。,如果及时采取措施，补充营养物质或取走代谢产物或改善培养条件、调节pH、调节温度、对好氧菌增加通气、搅拌或振荡等措施延长稳定生长期，以获得更多的菌体物质或代谢产物。,第二节细菌的群体生长繁殖,一、生长的规律,衰亡期(Decline或Deathphase)：,营养物质耗尽和有毒代谢产物的大量积累，细菌死亡速率逐步增加和活细菌逐步减少，整个群体呈现出负增长。该时期细菌代谢活性降低，细菌衰老并出现自溶。死亡的细菌以对数方式增加，但在衰亡期的后期，由于部分细菌产生抗性也会使细菌死亡的速率降低。,不同的微生物或同一种微生物对不同物质的利用能力是不同的。有的物质可直接被利用(例如葡萄糖或NH+4等)；有的需要经过一定的适应期后才能获得利用能力（例如乳糖或NO3-等）。前者通常称为速效碳源（或氮源），后者称为迟效碳源（或氮源）。微生物在同时含有速效碳源(或氮源)和迟效碳源(或氮源)的培养基中生长时，微生物首先会利用速效碳源(或氮源)生长直至该速效碳源(或氮源)耗尽，然后经过短暂的停滞后，再利用迟效碳源（或氮源）重新开始生长，这种生长称为二次生长。,利用葡萄糖,利用乳糖,时间,菌数/lg,四、同步培养,同步培养(Synchronousculture)：,使群体中的细胞处于比较一致的，生长发育均处于同一阶段上，即大多数细胞能同时进行生长或分裂的培养方法。,以同步培养方法使群体细胞能处于同一生长阶段，并同时进行分裂的生长。,同步生长：,通过同步培养方法获得的细胞被称为同步细胞或同步培养物,第二节细菌的群体生长繁殖,四、同步培养,同步培养物常用来研究在单个细胞上难以研究的生理与遗传特性和作为工业发酵的种子，它是一种理想的材料。,机械法,离心法过滤分离法硝酸纤维素滤膜法,环境条件控制技术,温度培养基成份控制其他（如光照和黑暗交替培养）,第二节细菌的群体生长繁殖,四、同步培养,硝酸纤维素滤膜法是最经典的获得同步生长的方法,由于细胞的个体差异，同步生长往往只能维持2-3个世代，随后又逐渐转变为随机生长。,五、连续培养,第二节细菌的群体生长繁殖,将微生物置于一定容积培养基中，经过培养生长，最后一次收获,分批培养（batchculture）or封闭培养（closedculture）,培养基一次加入，不予补充，不再更换。,连续培养(Continousculture）,在微生物的整个培养期间，通过一定的方式使微生物能以恒定的比生长速率生长并能持续生长下去的一种培养方法。,培养过程中不断的补充营养物质和以同样的速率移出培养物是实现微生物连续培养的基本原则。,第二节细菌的群体生长繁殖,五、连续培养,连续培养的类型,恒浊器连续培养,不断调节流速而使细菌培养液浊度保持恒定,恒化器连续培养,保持恒定的流速,第二节细菌的群体生长繁殖,五、连续培养,（一）恒浊器连续培养,测定所培养微生物的光密度值,自动调节新鲜培养基流入和培养物流出培养室的流速,使培养物维持在某一恒定浊度,当培养室中的浊度超过预期数值时，流速加快，使浊度降低当培养室中的浊度低于预期数值时，流速减慢，使浊度升高,恒浊培养器的工作精度是由光电控制系统的灵敏度来决定的,如果所用培养基中有过量的必需营养物，就可以使菌体维持最高的生长速率。,第二节细菌的群体生长繁殖,五、连续培养,（一）恒浊器连续培养,一般用于菌体以及与菌体生长平行的代谢产物生产的发酵工业,（连续发酵）,连续发酵与单批发酵相比的优点：,缩短发酵周期，提高设备利用率；便于自动控制；降低动力消耗及体力劳动强度；产品质量较稳定；,缺点：杂菌污染和菌种退化,第二节细菌的群体生长繁殖,五、连续培养,（二）恒化器连续培养,使培养液流速保持不变，并使微生物始终在低于其最高生长速率下进行生长繁殖。,第二节细菌的群体生长繁殖,五、连续培养,（二）恒化器连续培养,恒化器连续培养中，必需将某种必需的营养物质控制在较低的浓度，以作为限制性因子，而其他营养物均过量。,细菌的生长速率取决于限制性因子的浓度，并低于最高生长速率,限制性因子必须是机体生长所必需的营养物质，如氨基酸和氨等氮源，或是葡萄糖、麦芽糖等碳源或者是无机盐，因而可在一定浓度范围内能决定该机体生长速率。,第二节细菌的群体生长繁殖,五、连续培养,通过控制流速可以得到生长速率不同但密度基本恒定的培养物,多用于科研,遗传学：突变株分离；生理学：不同条件下的代谢变化；生态学：模拟自然营养条件建立实验模型；,第四节环境对生长的影响及生长的测定,一、环境对微生物生长的影响,影响微生物生长的主要因素,营养物质水的活度温度pHO2,1、营养物质营养物质不足导致微生物生长所需要的能量、碳源、氮源、无机盐等成分不足，机体一方面降低或停止细胞物质合成，避免能量的消耗，或者通过诱导合成特定的运输系统，充分吸收环境中微量的营养物质以维持机体的生存。另一方面机体对胞内某些非必需成分或失效的成分进行降解以重新利用。,2、水的活度微生物在生长过程中，对培养基的水活度W有一定的要求，每种微生物生长都有最适的W，高于或低于所要求的W值，都会通过影响培养基德渗透压力变化而影响微生物的生长速率。细菌生长所需要的W值高，真菌生长所需要W值较低。,根据微生物生长的最适温度不同，可以将微生物分为嗜冷、兼性嗜冷、嗜温、嗜热和超嗜热等5种不同的类型。温度的变化都会对每种类型微生物的代谢过程产生影响，微生物的生长速率会发生改变，以适应温度的变化。温度对微生物生长的影响表现为：（1）影响酶活性。（2）影响细胞质膜的流动性。（3）影响物质的溶解度。,4、pH,微生物生长有一个最适生长的pH范围，还有一个最低与最高的pH范围。低于或高出这个范围，微生物的生长就被抑制。pH通过影响细胞质膜的透性、膜结构的稳定性和物质的溶解性或电离性来影响营养物质的吸收，从而影响微生物的生长速率。,5、氧,根据氧与微生物生长的关系可将微生物分为好氧、微好氧、耐氧厌氧、兼性厌氧、和专性厌氧5种类型。在培养不同类型的微生物时，一定要采取相应的措施保证不同类型的微生物能正常生长。好氧微生物：振荡、通气厌氧微生物：排除环境中的氧、添加还原剂兼性厌氧或耐氧厌氧微生物：深层静止培养,第五节微生物生长繁殖的控制,控制（有害）微生物的生长速率或消灭不需要的微生物，在实际应用中具有重要的意义。,抑制(Inhibition)：生长停止，但不死亡；,防腐作用(Antisepsis)：抑制霉腐微生物在食品等物质上的生长,消毒作用(Disinfection)：杀死或灭活病原微生物（营养体细胞）；,灭菌作用(Sterilization)：杀死包括芽孢在内的所有微生物；,第五节微生物生长繁殖的控制,影响抑菌或杀菌作用的相关因素：,理化因子的强度或浓度；同一浓度理化因子作用时间的长短；不同种类的微生物；同种微生物的不同生长时期；,第三节微生物生长繁殖的控制,一、控制微生物的化学物质,抗微生物剂(Antimicrobialagent),生物合成的天然产物,人工合成的化合物,一类能够杀死微生物或抑制微生物生长的化学物质,第五节微生物生长繁殖的控制,一、控制微生物的化学物质,抗微生物剂,抑菌：,抑菌剂(Bacteriostaticagent),杀菌:,杀菌剂(Bactericide),溶菌剂(Bacteriolysis),待测化学物质对数生长培养物定时测定总菌数和活菌数,第五节微生物生长繁殖的控制,一、控制微生物的化学物质,抗微生物剂,非选择性（对所有细胞均有毒性）,有选择性（对病原微生物毒性更强）,消毒剂(Disinfectant),防腐剂(Antisepsis),抗代谢药物,抗生素,中草药有效成分,（化学治疗剂）,第五节微生物生长繁殖的控制,一、控制微生物的化学物质,（一）防腐剂和消毒剂,特点：对一切活细胞都有毒性，不能用于人或动物体内的化学治疗,消毒剂：可杀死微生物，通常用于非生物材料的灭菌或消毒。,防腐剂：能杀死微生物或抑制其生长，但对人及动物的体表组织无毒性或毒性低，可作为外用抗微生物药物。,第五节微生物生长繁殖的控制,一、控制微生物的化学物质,防腐剂和消毒剂,广泛用于一些热敏感的或无法进行高温灭菌的物品或场所的灭菌,温度计、带有透镜的仪器设备、聚乙烯管或导管等；墙壁、楼板与仪器设备等表面和自来水；空气；,第五节微生物生长繁殖的控制,一、控制微生物的化学物质,2、抗代谢物,有些化合物在结构上与生物体所必需的代谢物很相似，以至可以和特定的酶结合，从而阻碍了酶的功能，干扰了代谢的正常进行，这些物质称为抗代谢物(Antimetabolite)。,叶酸对抗物（磺胺）、嘌呤对抗物（6-巯基嘌呤）、苯丙氨酸对抗物（对氟苯丙氨酸）、尿嘧啶对抗物（5-氟尿嘧啶）胸腺嘧啶对抗物（5-溴胸腺嘧啶）等等,第五节微生物生长繁殖的控制,一、控制微生物的化学物质,2、抗代谢物,磺胺药物是最早发现，也是最常见的化学疗剂，抗菌谱广，能治疗多种传染性疾病。,大多数革兰氏阳性细菌（如肺炎球菌、溶血性链球菌等）某些革兰氏阴性细菌（痢疾杆菌、脑膜炎球菌、流感杆菌等）对放线菌也有一定的作用。,1934年，德国I.G.Farben染料厂的G.Domagk,一种红色染料（prontosil），白鼠静脉注射，可治疗因链球菌引起的感染，但在体外却无作用。1935年，进一步证明prontosil对人的链球菌病也有效。,法国人Trefouel和英国人Fuller,prontosil在体内转化成了具有抑菌作用的磺胺,第五节微生物生长繁殖的控制,一、控制微生物的化学物质,2、抗代谢物,磺胺是叶酸组成部分对氨基苯甲酸的结构类似物,作用机理：,磺胺的抑菌作用是因为很多细菌需要自己合成叶酸而生长。,磺胺对人体细胞无毒性，因为人缺乏从对氨基苯甲酸合成叶酸的相关酶-二氢叶酸合成酶，不能用外界提供的对氨基苯甲酸自行合成叶酸，而必须直接利用叶酸为生长因子进行生长。,第五节微生物生长繁殖的控制,一、控制微生物的化学物质,3、抗生素,是由某些生物合成或半合成的一类次级代谢产物或衍生物，它们在很低浓度时就能抑制或影响它种生物的生命活动，如杀死微生物或抑制其生长。,抗生素(Antibiotic)：,1、概念,自本世纪40年代以来，已找到上万种新抗生素，合成了近10万种半合成抗生素，但其中在临床上常用的仅几十种。,第五节微生物生长繁殖的控制,一、控制微生物的化学物质,3、抗生素,作用机制,抑制细菌细胞壁合成、破坏细胞质膜、作用于呼吸链以干扰氧化磷酸化、抑制蛋白质和核酸合成等,抑制微生物的生长或杀死它们,第五节微生物生长繁殖的控制,一、控制微生物的化学物质,3、抗生素,作用机制,第五节微生物生长繁殖的控制,一、控制微生物的化学物质,3、抗生素,作用机制,一、控制微生物的化学物质,3、抗生素,作用机制,第五节微生物生长繁殖的控制,一、控制微生物的化学物质,3、抗生素,青霉素b-内酰胺环结构与D-丙氨酸末端结构相似，从而能占据D-丙氨酸的位置与转肽酶结合，并将酶灭活，肽链之间无法彼此连接，抑制了细胞壁的合成。,作用机制,第三节微生物生长繁殖的控制,一、控制微生物的化学物质,3、抗生素,作用机制,由于不同微生物之间的细胞化学结构和代谢的差异，不同的抗生素的抗菌谱各异。,第三节微生物生长繁殖的控制,一、控制微生物的化学物质,3、抗生素,细菌抗药性的产生,抗性菌株特点：,细胞质膜透性改变，使抗生素不进入细胞或进入细胞后被细胞主动排出；药物作用靶改变；合成了修饰抗生素的酶；抗性菌株发生遗传变异，导致合成新的多聚体，以取代或部分取代原来的多聚体；,第三节微生物生长繁殖的控制,一、控制微生物的化学物质,3、抗生素,细菌抗药性的产生,避免出现细菌的耐药性的措施：,(1)第一次使用的药物剂量要足；(2)避免在一个时期或长期多次使用同种抗生素；(3)不同的抗生素(或与其他药物)混合使用；(4)对现有抗生素进行改造；(5)筛选新的更有效的抗生素；,第三节微生物生长繁殖的控制,二、控制微生物的物理因素,杀灭或抑制微生物的物理因素,温度辐射作用过滤渗透压干燥超声波等,第五节微生物生长繁殖的控制,二、控制微生物的物理因素,1、高温灭菌,当温度超过微生物生长的最高温度或低于生长的最低温度都会对微生物产生杀灭作用或抑制作用。,第五节微生物生长繁殖的控制,二、控制微生物的物理因素,1、高温灭菌,高温使蛋白质、核酸等重要生物大分子发生变性、破坏，以及破坏细胞膜上的类脂成分，导致微生物死亡。,温度愈高，十倍致死时间愈短,二、控制微生物的物理因素,1、高温灭菌,D值大小还随微生物的种类、生长时期、检测培养基的性质等因素有关。,二、控制微生物的物理因素,1、高温灭菌,高温的杀菌时间与样品中的微生物浓度有关。,当微生物的浓度一致时，可以通过比较热致死时间长短来衡量不同微生物的热敏感性。,第三节微生物生长繁殖的控制,二、控制微生物的物理因素,1、高温灭菌,烘箱内热空气灭菌火焰灼烧,干热灭菌,165，2小时,二、控制微生物的物理因素,1、高温灭菌,湿热比干热