生物化学复习-蛋白质

第一章蛋白质化学,蛋白质是许多不同的-氨基酸按一定的序列酰胺键（蛋白质化学中专称为肽键）缩合而成的，具有较稳定的构象并具有一定的生物大分子,Protein,第一节蛋白质的元素组成,N含量在各种蛋白质中比较接近15%18%，平均为16%。每1g氮相当于6.25g的蛋白质,蛋白质平均含N量为16,这是凯氏定氮法测定蛋白质含量的理论依据：粗蛋白质含量蛋白质含N量6.25,方法：常用6mol/L的盐酸或4mol/L的硫酸，回流煮沸时间约20h。优点：不引起消旋作用，得到的是L-氨基酸。缺点：色氨酸被沸酸完全破坏；含有羟基的氨基酸（丝氨酸、苏氨酸）有一小部分被分解；天冬酰胺和谷氨酰胺的酰胺基被水解成了羧基。,第二节蛋白质的氨基酸组成,1.酸水解,一、蛋白质的水解,2.碱水解,方法：一般用5mol/L氢氧化钠煮沸1020h。优点：色氨酸在水解中不受破坏。缺点：多数氨基酸受到不同程度的破坏，产生消旋现象，得到的是D-和L-氨基酸的混合物。此外，引起精氨酸脱氨（生成鸟氨酸和尿素）。,3.酶水解,方法：用于蛋白质肽链断裂的蛋白水解酶或称蛋白酶（proteinase）已有十多种，常用的有胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶（或称糜蛋白酶）及胃蛋白酶等。优点：不产生消旋作用，也不破坏氨基酸。水解位点特异，用于一级结构分析，肽谱缺点：使用一种酶往往水解不彻底，需几种酶协同作用才能使蛋白质完全水解。该法主要用于部分水解。,二、氨基酸的功能：,1.组成蛋白质2.一些aa及其衍生物充当化学信号分子-aminobutyricacid(-氨基丁酸)、Serotonic(5-羟色胺，血清紧张素)、melatonin(褪黑激素，N-乙酰-甲氧基色胺)，都是神经递质，后二者是色氨酸衍生物(神经递质是一个神经细胞产生的影响第二个神经细胞或肌肉细胞功能的物质)。Thyroxine(甲状腺素，动物甲状腺thyroidgland产生的Tyr衍生物)和吲哚乙酸(植物中的Trp衍生物)都是激素(激素就是一个细胞产生的调节其它细胞的功能的化学信号分子)。,3.氨基酸是许多含N分子的前体物核苷酸和核酸的含氮碱基、血红素、叶绿素的合成都需要aa4.一些基本氨基酸和非基本aa是代谢中间物精氨酸、Citrulline(瓜氨酸)、Ornithine(鸟氨酸)是尿素循不(Ureacycle)的中间物，含氮废物在脊椎动物肝脏中合成尿素是排除它们的一种重要机制。,三、氨基酸的结构与分类1809年发现Asp，1938年发Thr，目前已发现180多种。但是组成蛋白质的aa常见的有20种，称为基本氨基酸（编码的蛋白质氨基酸），还有一些称为稀有氨基酸，是多肽合成后由基本aa经酶促修饰而来。此外还有存在于生物体内但不组成蛋白质的非蛋白质氨基酸(约150种)。（一）编码的蛋白质氨基酸（20种）也称基本氨基酸或标准氨基酸，有对应的遗传密码。,-氨基酸的一般结构氨基在-位，为L-构型.,除脯氨酸外，均为-氨基酸除甘氨酸外，均为手性氨基酸,氨基酸的分类,1.按R基的化学结构分类可以分为三类：脂肪族、芳香族和杂环族脂肪族氨基酸含一氨基一羧基的中性氨基酸,甘氨酸Gly,G,丙氨酸Ala,A,缬氨酸Val,V,亮氨酸Leu,L,异亮氨酸Ile,I,R基均为中性烷基（Gly为H），R基对分子酸碱性影响很小，它们几乎有相同的等电点。（6.00.03）Gly是唯一不含手性碳原子的氨基酸，因此不具旋光性。从Gly至Ile，R基团疏水性增加，Ile是这20种a.a中脂溶性最强的之一（除Phe2.5、Trp3.4、Tyr2.3以外）。,丝氨酸（Ser,S）,苏氨酸（Thr,T）,半胱氨酸（Cys,C）,甲硫氨酸（Met,M）,含羟基或硫脂肪族氨基酸,含羟基的有两种：Ser和ThrSer的-CH2OH基（pKa=15），在生理条件下不解离，但它是一个极性基团，能与其它基团形成氢键，具有重要的生理意义。在大多数酶的活性中心都发现有Ser残基存在。Thr中的-OH是仲醇，具有亲水性，但此-OH形成氢键的能力较弱，因此，在蛋白质活性中心中很少出现。Ser和Thr的-OH往往与糖链相连，形成糖蛋白。含硫的两种：Cys、MetCys中R含巯基（-SH），Cys具有两个重要性质：（1）在较高pH值条件，巯基离解。（2）两个Cys的巯基氧化生成二硫键，生成胱氨酸(CysssCys),二硫键在蛋白质的结构中具有重要意义。Cys还常常出现在酶的活性中心。Met的R中含有甲硫基（-SCH3），硫原子有亲核性，易发生极化，因此，Met是一种重要的甲基供体。Cys与结石在细胞外液如血液中，Cys以胱氨酸(Cystine)氧化形式存在，胱氨酸的溶解性最差。胱氨酸尿(Cystinuria)是一种遗传病，由于胱氨酸的跨膜运输缺陷导致大量的胱氨酸排泄到尿中。胱氨酸在肾(Kidney)、输尿管(ureter)、膀胱(urinarybladder)中结晶形成结石(Calculus,calculi)，结石会导致疼痛、发炎甚至尿血。大量服用青霉胺(Penicillcemine)能降低肾中胱氨的含量，因为青霉胺与半胱氨酸形成的化合物比胱氨酸易溶解。,酸性氨基酸及酰胺,天冬氨酸（Asp,D）,谷氨酸（Glu,E）,天冬酰胺（Asn,N）,谷氨酰胺（Gln,Q）,Asp、Glu，一般称酸性氨基酸Asp侧链羧基pKa（-COOH）为3.86，Glu侧链羧基pKa（-COOH）为4.25它们是在生理条件下带有负电荷的仅有的两个氨基酸。Asn、Gln酰胺基中氨基易发生氨基转移反应，转氨基反应在生物合成和代谢中有重要意义,碱性氨基酸,赖氨酸（Lys,K）,精氨酸（Arg,R）,Lys的R侧链上含有一个氨基，侧链氨基的pKa为10.53。生理条件下，Lys侧链带有一个正电荷（NH3+），同时它的侧链有4个C的直链，柔性较大，使侧链的氨基反应活性增大。（如肽聚糖的短肽间的连接）Arg是碱性最强的氨基酸，侧链上的胍基是已知碱性最强的有机碱，pKa值为12.48，生理条件下完全质子化。,His含咪唑环，咪唑环的pKa在游离氨基酸中和在多肽链中不同，前者pKa为6.00，后者为7.35，它是20种氨基酸中侧链pKa值最接近生理pH值的一种，在接近中性pH时，可离解平衡。它是在生理pH条件下唯一具有缓冲能力的氨基酸。His含咪唑环，一侧去质子化和另一侧质子化同步进行，因而在酶的酸碱催化机制中起重要作用。,2、芳香族氨基酸,苯丙氨酸（Phe,F）,酪氨酸（Tyr,Y）,色氨酸（Trg,W）,都具有共轭电子体系,易与其它缺电子体系或电子体系形成电荷转移复合物(charge-transfercomplex)或电子重叠复合物。在受体底物、或分子相互识别过程中具有重要作用。这三种氨基酸在近紫外区有特殊吸收峰，蛋白质的紫外吸收主要来自这三种氨基酸，在280nm处，TrpTyrPhe。Phe疏水性最强.。酪氨酸的-OH磷酸化是一个十分普遍的调控机制，Tyr在较高pH值时，酚羟基离解。Trp有复杂的共轭休系，比Phe和Tyr更易形成电荷转移络合物。,3、杂环氨基酸,组氨酸（His,H）,脯氨酸（Pro,P）,Pro，有时也把His、Trp归入此类。Pro是唯一的一种环状结构的氨基酸，它的-亚氨基是环的一部分，因此具有特殊的刚性结构。它在蛋白质空间结构中具有极重要的作用，一般出现在两段-螺旋之间的转角处，Pro残基所在的位置必然发生骨架方向的变化,2.按R基的极性分类(能否与水形成氢键),20种基本氨基酸可以分成以下四组：1、非极性氨基酸（八种）Ala、Val、Leu、Ile、Phe、Trp、Met、Pro这类氨基酸的R基都是疏水性的，在维持蛋白质的三维结构中起着重要作用。,2、极性不带电荷的氨基酸（七种）6种，丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺。这类氨基酸的侧链都能与水形成氢键，因此很容易溶于水。酪氨酸的-OH磷酸化是一个十分普遍的调控机制，Ser和Thr的-OH往往与糖链相连，Asn和Gln的-NH2很容易形成氢键，因此能增加蛋白质的稳定性。,3、极性带正电荷的氨基酸,三种碱性氨基酸：Lys、Arg、His在pH7时带正电荷。当胶原蛋白中的Lys侧链氧化时能形成很强的分子间(内)交联。Arg的胍基碱性很强，与NaOH相当。His是一个弱碱，在pH6.0时，His的R基50%以上质子化，但pH7.0时，质子化的分子不到10%His是R基的pK值在7附近的唯一的氨基酸。是天然的缓冲剂，它往往存在于许多酶的活性中心。,4、极性带负电荷的氨基酸两种酸性氨基酸：Asp、Glu。在pH67时，谷氨酸和天冬氨酸的第二个羧基解离，因此，带负电荷。酶的活性中心：His、Ser、Cys非极性aa一般位于蛋白质的疏水核心，带电荷的aa和极性aa位于表面。,三个有特性的氨基酸,一是脯氨酸（Pro），因为它是一个环状的亚氨基酸。它的氨基和其它氨基酸的羧基形成的肽键有明显的特点，较易变成顺式肽键。,二是甘氨酸（Gly），它是唯一的在碳原子上只有两个氢原子，没有侧链的氨基酸。为此它既不能和其它残基的侧链相互作用，也不产生任何位阻现象，进而在蛋白质的立体结构形成中有其特定的作用。第三个是半胱氨酸(Cys)。它的个性不仅表现在其侧链有一定的大小和具有高度的化学反应活性，还在于两个Cys能形成稳定的带有二硫（桥）键的胱氨酸。二硫键不仅可以在肽链内，也可以在肽链间存在。更有甚者，同样的一对二硫键能具有不同的空间取向。,（浙江大学2006年题）按氨基酸R基的极性性质将其分为哪几类？请写出各类的性质，氨基酸的名称以及三字符号和单子符号解析：主要考察编码蛋白质的20种氨基酸的结构和极性及单字和三字符号,二、非编码的蛋白质氨基酸也称修饰氨基酸，是在蛋白质合成后，由基本氨基酸修饰而来。Prothrombin(凝血酶原)中含有-羧基谷氨酸，能结合Ca2+。结缔组织中最丰富的蛋白质胶原蛋白含有大量4-羟脯氨酸和5-羟赖氨酸。（1）4-羟脯氨酸（2）5-羟赖氨酸这两种氨基酸主要存在于结缔组织的纤维状蛋白（如胶原蛋白）中。（3）6-N-甲基赖氨酸（存在于肌球蛋白中）(4)-羧基谷氨酸存在于凝血酶原及某些具有结合Ca2+离子功能的蛋白质中。（5）Tyr的衍生物：3.5-二碘酪氨酸、甲状腺素（甲状腺蛋白中）（6）锁链素由4个Lys组成（弹性蛋白中）。,（三）非蛋白质氨基酸除参与蛋白质组成的20多种氨基酸外，生物体内存在大量的氨基酸中间代谢产物，它们不是蛋白质的结构单元，但在生物体内具有很多生物学功能，如尿素循环中的L-瓜氨酸和L-鸟氨酸。（1）L-型氨基酸的衍生物L-瓜氨酸L-鸟氨酸（2）D-型氨基酸D-Glu、D-Ala（肽聚糖中）、D-Phe（短杆菌肽S）（3）-、-、-氨基酸-Ala（泛素的前体）、-氨基丁酸（神经递质）。,-丙氨酸是遍多酸（泛酸）（一种维生素）的前体成分氨基丁酸是传递神经冲动的化学介质L-瓜氨酸、L-鸟氨酸是尿素循环的中间体,甜菜碱,肌氨酸,鸟氨酸,胍氨酸,四、氨基酸的重要理化性质,（一）一般物理性质-氨基酸为无色晶体，熔点极高，一般在200以上。有的无味、有的味甜、有的味苦、谷氨酸的单钠盐有鲜味，是味精的主要成分。各种氨基酸在水中的溶解度差别很大，除胱氨酸和酪氨酸外一般都能溶于水，并能溶解于稀酸或稀碱中，但不能溶解于有机溶剂。通常酒精能把氨基酸从其溶液中沉淀析出。脯氨酸和羟脯氨酸能溶于乙醇或乙醚中。,（二）氨基酸的光吸收,构成蛋白质的20种氨基酸在可见光区都没有光吸收，但在远紫外区(3.5，-羧基以-COO-形式存在。-氨基pK2在9.4左右，当pHpH，两性离子带净正电荷，若pIpH，两性离子带净负电荷。差值越大，所带的净电荷越多。,离子交换柱层析（ion-exchangecolumnchromatography）,磺酸型阳离子交换树脂,树脂先用含Na的缓冲液处理成钠盐，且pH在2左右，将氨基酸混合液（pH2-3）上柱，氨基酸此时是阳离子，与树脂上的钠离子交换，被固定在树脂上。作用力：（1）静电吸引，（2）氨基酸侧链与树脂基质(聚苯乙烯)的疏水作用力,用氨基酸自动分析仪分析氨基酸混合物的洗脱曲线（阳离子交换剂）。洗脱的先后顺序取决于氨基酸的所带电荷与离子交换树脂的静电吸引和疏水相互作用两者的综合作用的结果。,1.用强酸型阳离子交换树脂分离下述氨基酸,当用pH7.0的缓冲溶液洗脱时,下述每对中先从柱上洗脱下来的是哪种氨基酸?(1)天冬氨酸和赖氨酸;(2)精氨酸和甲硫氨酸;(3)谷氨酸和缬氨酸(4)甘氨酸和亮氨酸;(5)丝氨酸和丙氨酸解析与要点:用