《氨基转换作用》PPT课件.ppt

实验六氨基转换作用,目的要求：了解转氨酶在代谢过程中的重要作用学习应用纸层析法鉴定氨基转换反应,实验原理,体内-氨基酸的-氨基在氨基转换酶的作用下，移换至-酮酸的过程，称氨基转换作用。,转氨酶(aminotransferase),转换酶中的一类。催化氨基酸和a-酮酸或醛酸之间的氨基转换反应，生成与原来的a-酮酸或醛酸相应的a-氨基酸或-氨基酸，原来氨基酸转变成相应的酮酸。转氨酶催化的反应都是可逆的。,转氨酶参与氨基酸的分解和合成，是人体代谢过程中必不可少的“催化剂”；以谷丙转氨酶（GPT）和谷草转氨酶（GOT）最为重要。GPT主要存在于肝脏、心脏和骨骼肌中，在肝脏中活力最大。GPT升高是肝脏功能出现问题的一个重要指标。,本实验是将谷氨酸与丙酮酸在肌肉糜中谷氨酸丙酮酸氨基转换酶（简称谷丙转氨酶）的作用下进行氨基转化反应，然后用纸层析法检查反应体系中丙氨酸的生成。,谷丙转氨酶,L谷氨酸,丙酮酸,-酮戊二酸,L丙氨酸,1,在反应体系中添加溴乙酸以抑制谷氨酸和丙酮酸的其他代谢过程。谷氨酸、丙酮酸（丙酮酸羧化酶系）糖异生途径谷氨酸、草酰乙酸在谷草转氨酶（GOT）催化转氨基生成天冬氨酸。丙酮酸：丙酮酸脱氢酶系催化生成乙酰辅酶A，进入TCA循环。,试剂和器材,试剂1%谷氨酸溶液（用1%KOH调到中性）；1%丙酮酸钠溶液（用1%KOH调到中性）；0.1%KHCO3溶液；0.025溴醋酸溶液（用1%KOH调到中性）；2%Hac溶液；0.1%标准谷氨酸；0.1%标准丙氨酸。展开剂：酚饱和水溶液：2份酚加1份水混合放入分液漏斗，振荡。静置24小时显色剂：0.1%茚三酮正丁醇溶液。,材料肌肉糜：取兔子肌肉1g，置研钵中，加0.9%氯化钠溶液3ml，在低温下研磨成细浆，离心5分钟（3000转/分），弃去沉淀，得肌肉糜提取液。,操作方法,一、转氨酶作用1、取试管2只编号（1、2），向每个试管各加0.5mL1%谷氨酸溶液,0.5mL1%丙酮酸钠溶液,0.5mL0.1%KHCO3和0.25mL0.025%溴醋酸,混匀。然后分别加入肌肉糜提取液0.5ml，混匀，将其中一试管立即在沸水浴中加热2-3分钟做对照。用试管帽塞住另一只试管，置于45水浴中保温40min。2.保温完毕，取出试管。向每只试管中各加2%HAc溶液4滴，再置于沸水浴中2min，使蛋白质完全沉淀。过滤收集滤液待用。,二、层析验证1.取9厘米培养皿一个，加入酚饱和水溶液约0.5cm高，取圆形滤纸一张，在中心剪一直径约2mm的小孔，并以圆心约1cm为半径划一圆作为底线。在此底线上，用铅笔点四个等距离的原点并标明1，2，3，4；2.用毛细管分别吸取以上两种滤液及标准谷氨酸、丙氨酸，依次点在标明号码的原点处，点样2-3次。注意斑点不能太大，一般直径约0.2cm为宜。3.另取一条滤纸卷成实心筒状，直径约23mm,将此小筒插入滤纸中心小孔（不可突出纸面之上），使层析滤纸通过此小筒与酚溶液相连。然后将滤纸平放在盛饱和酚的培养皿上。另取一大小相同的培养皿盖在滤纸上，此时酚溶液即由滤纸中心孔向四周扩散。,4.当酚溶液扩展到直径约7cm时，取出滤纸。用铅笔画下酚溶液扩展边缘，用吹风机吹干。用喷雾器喷以0.1%茚三酮正丁醇溶液，再用热风吹干。用铅笔圈下各显色点。测定各显色点的Rf值，并解释之。注意:当温度、滤纸质量和展开剂等都相同时，对于一个化合物比移值Rf是一个特有的常数。,三、计算公式,Rf原点至斑点中心的距离/原点至溶剂前