DNA重组技术的基本工具--精华版

专题1基因工程,基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，并通过体外DNA重组和转基因等技术，赋予生物以新的遗传特性，从而创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫做DNA重组技术。,1DNA重组技术的基本工具,第1节,问题探讨,手术刀,缝合针,运输工具,培育抗虫棉需要哪些基本工具?,基因拼接技术或DNA重组技术,生物体外,基因,DNA分子水平,人类需要的基因产物,剪切,拼接,导入,表达,基因重组,基因工程的概念,问题探讨：,苏云金芽孢杆菌含有一种可以合成毒蛋白的基因。让细菌的毒蛋白基因在棉花细胞中表达，可培育出抵抗棉铃虫害的抗虫棉。想一想需要做哪些关键工作？,普通棉花抗虫棉,普通棉花(无抗虫特性),苏云金芽孢杆菌,提取,抗虫基因,棉花细胞(含抗虫基因),棉花植株(有抗虫特性),上述培育抗虫棉的关键步骤是什么？,重组DNA,导入,形成,基因工程培育抗虫棉的简要过程,基因工程培育抗虫棉的关键步骤,关键步骤一：,抗虫基因从苏云金芽孢杆菌细胞内提取出来,关键步骤二：,形成重组DNA,关键步骤三：,重组DNA导入受体(棉花)细胞,1.1DNA重组技术的基本工具,关键步骤一：,抗虫基因从苏云金芽孢杆菌细胞内提取出来,关键步骤二：,形成重组DNA,关键步骤三：,重组DNA导入受体(棉花)细胞,“分子手术刀”限制性核酸内切酶,“分子缝合针”DNA连接酶,“分子运输车”基因进入受体细胞的载体,“分子手术刀”限制性核酸内切酶,主要来源：,2.种类与命名：,3.作用：,4.作用结果：,主要是从原核生物中分离纯化出来的一类酶。,约4000种,识别特定的核苷酸序列，断裂磷酸二酯键。,形成粘性末端或平末端,阅读课本4-5页“限制性核酸内切酶分子手术刀”的相关内容，填写下表,自主学习,主要从原核生物中分离纯化而来,已经分离出大约4000种,1、识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列,2、使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。,形成两种末端：黏性末端或平末端,脱氧核苷酸的结构,G,A,3,5-磷酸二酯键,3端,5端,3端,5端,磷酸二酯键,13,仔细观察各限制酶识别的特定序列有何特点？,限制酶的识别序列,限制酶所识别的序列的特点是：呈现碱基互补对称，无论是6个碱基还是4个碱基，都可以找到一条中心轴线，中轴线两侧的双链DNA上的碱基是反向对称重复排列的，称为回文序列,限制酶的识别序列：,能被限制性内切酶特异性识别的切割部位都具有回文序列：在切割部位，一条链正向读的碱基顺序与另一条链反向读的顺序完全一致。,中轴线,在G与A之间切割,大肠杆菌的一种限制酶(EcoR)只能识别GAATTC序列，并在G和A之间切开。,EcoRI限制酶的作用,黏性末端,黏性末端,EcoRI限制酶的切割,被限制酶切开的DNA两条单链的切口，带有几个伸出的核苷酸，他们之间正好互补配对，这样的切口叫黏性末端。,SmaI只能识别CCCGGG序列，并在C和G之间切开。,中轴线,SmaI限制酶的作用,在G与C之间切割,平末端平末端,SmaI限制酶的切割,当限制酶从识别序列的中心轴线处切开时，切开的DNA两条单链的切口，是平整的，这样的切口叫平末端。,以下是两种限制酶切割后形成的DNA片段，试分析：GCAATTCGCCTTAACGGCGG,(1)其中和是由一种限制酶切割形成的末端，所用限制酶是。（2）和是由另一种限制酶切割形成的末端，所用的限制酶可以是。,反馈练习,SmaI限制酶,EcoRI限制酶,在基因工程中，切割运载体和含有目的基因的DNA片段，需使用（）同种限制酶B.两种限制酶同种连接酶D.两种连接酶,反馈练习,你能推测限制酶存在于原核生物中的作用是什么吗？,原核生物易受自然界外源DNA的入侵，但生物在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机制，以防止外来病原物的侵害。限制酶就是细菌的一种防御性工具，当外源DNA侵入时，会利用限制酶将外源DNA切割掉，以保证自身的安全。所以，限制酶在原核生物中主要起到切割外源DNA、使之失效，从而达到保护自身的目的。,寻根问底,寻根问底,为什么限制酶不剪切细菌本身的DNA？,通过长期的进化，细菌中含有某种限制酶的细胞，其DNA分子中不具备这种限制酶的识别切割序列，或者通过甲基化酶将甲基转移到所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开。这样，尽管细菌中含有某种限制酶也不会使自身的DNA被切断，并且可以防止外源DNA的入侵。,23,类型,来源,功能,相同点,差别,EcoliDNA连接酶,T4DNA连接酶,大肠杆菌,T4噬菌体,恢复磷酸二酯键,只能连接黏性末端,能连接黏性末端和平末端(效率较低),阅读课本第5页“分子缝合针”DNA连接酶的相关内容，填写下表,自主学习,把切下来的DNA片段拼接成新的DNA，即将脱氧核糖和磷酸连接起来催化形成磷酸二酯键,DNA连接酶的作用,两DNA片段要具有互补的黏性末端才能拼起来,DNA连接酶的缝合作用,可把黏性末端之间的缝隙“缝合”起来，,注意：DNA连接酶可连接双链DNA中的两条单链缺口，但不能连接单链DNA！,DNA连接酶与DNA聚合酶是一回事吗？,T4DNA连接酶还可把平末端之间的缝隙“缝合”起来，但效率较低,DNA连接酶的缝合作用,DNA聚合酶连接单链DNA把单个脱氧核苷酸连接到DNA片段上,都能催化形成磷酸二酯键,都是蛋白质,不需要,需要DNA的一条链作为模板,形成完整的重组DNA分子,形成DNA的一条链,基因工程,DNA复制,DNA连接酶与DNA聚合酶的比较,只能将单个核苷酸连接到已有的DNA片段上，形成磷酸二酯键,在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键,小试身手,DNA连接酶催化的反应是（）A、DNA复制时母链与子链之间形成氢键B、黏性末端碱基之间形成氢键C、两个DNA片断黏性末端之间的缝隙的连接D、A、B、C都不正确,c,以下是两种限制酶切割后形成的DNA片段，试分析：GCAATTCGCCTTAACGGCGG,(1)其中和是由一种限制酶切割形成的末端，两者要重组成一个DNA分子，所用DNA连接酶通常是。（2）和是由另一种限制酶切割形成的末端，两者要形成重组DNA片段，所用的连接酶通常是。,反馈练习,T4DNA连接酶,EcoliDNA连接酶和T4DNA连接酶,限制酶与DNA解旋酶、DNA水解酶的比较,使特定部位的磷酸二酯键断裂,将DNA二条链之间的氢键断开,将DNA水解成单个脱氧核苷酸,都作用于DNA分子中的化学键,使特定部位的磷酸二酯键断裂,在DNA片段之间形成磷酸二酯键,用于提取目的基因和切割载体,用于连接目的基因和运载体,比较,载体的作用,载体的必要条件,载体的种类,阅读课本第6页“分子运输车”载体的相关内容，填写下表,自主学习,1）能够在宿主细胞中复制并稳定地保存。2）具一个或多个限制酶切点，以便与外源基因连接。3）具有某些标记基因，便于进行鉴定和选择。4）必须是安全的，对受体细胞无害。5）载体DNA分子应大小适中，以便于提取和操作,1）作为运载工具，将目的基因导入受体细胞中2）在受体细胞内对目的基因进行大量复制,细菌的质粒病毒：噬菌体衍生物、动植物病毒等。,有标记基因的存在，可用含青霉素的培养基鉴别。,有切割位点,能复制并带着插入的目的基因一起复制,质粒裸露的、结构简单的、独立于细菌染色体（即拟核DNA）之外，并具有自我复制能力的很小的双链环状DNA分子。对宿主细胞没有影响，主要存在于细菌和酵母菌体内。其中最常用的是大肠杆菌质粒。,最常用运载体质粒,实际上在基因工程操作中，真正被用作载体的质粒，都是在天然质粒的基础上进行过人工改造的。,（双选）关于质粒的叙述正确的A.质粒是能够自我复制的环状DNA分子B.质粒是基因工程常用的载体C.重组质粒是目的基因D.质粒可在宿主外单独复制,AB,反馈练习,小结升华,课本知识回顾,基因工程又叫做或。通俗地说，就是按照人们的意愿，把一种生物的某种提取出来，加以，然后放到另一种生物的细胞里，改造生物的遗传性状。,基因拼接技术,DNA重组技术,基因,修饰改造,定向地,DNA重组技术的基本工具,“分子手术刀”,“分子缝合针”,“分子运输车”,限制（性核酸内切）酶,DNA连接酶,载体,限制性核酸内切酶,主要是从的一种酶。识别双链DNA分子的某种，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的断开。形成两种末端,原核生物中分离纯化出来,特定的核苷酸序列,磷酸二酯键,粘性末端,平末端,“分子缝合针”DNA连接酶,1、种类：2、作用部位：,两类,连接黏性末端,EcoliDNA连接酶,T4DNA连接酶,磷酸二酯键,连接黏性末端和平末端,基因进入受体细胞的载体,通常有三种:作为载体的条件：在进行基因工程操作中,真正被用作载体的质粒都是在,质粒,噬菌体衍生物,动植物病毒,天然质粒,人工改造,的,能自我复制；有切割位点；有遗传标记基因；对受体细胞无害、易分离,基础上进行过,练习,在基因工程中，切割运载体和含有目的基因的DNA片段，需使用（）同种限制酶B.两种限制酶同种连接酶D.两种连接酶,不属于质粒被选为基因运载体的理由是A、能复制（）B、有多个限制酶切点C、具有标记基因D、它是环状DNA,D,练习,下列关于限制酶和DNA连接酶的理解正确的是A、其化学本质都是蛋白质B、DNA连接酶可以恢复DNA中的氢键C、在基因工程操作中可以用DNA聚合酶代替DNA连接酶D、他们不能被反复的利用,巩固提高,A,糖尿病是一种常见病，且发病率有逐年增加的趋势，以致发达国家把它列为第3号“杀手”。请回答下列问题：（1）目前，对糖尿病