丙型肝炎病毒感染的抗体应答及其免疫测定

丙型肝炎病毒感染的抗体应答及其免疫测定,卫生部临床检验中心李金明,?,丙型肝炎病毒(HepatitisCvirus,HCV)是输血后肝炎的主要病原；目前的检测手段主要是采用ELISA方法检测献血员血中的抗HCV抗体；HCV感染者血循环中存在针对HCV不同蛋白的抗体，且具体针对某种蛋白的抗是否出现、出现的时间、持续时间长度均有所差异，因此，ELISA测定时所使用的包被抗原必须全面，才能有效地检出所存在抗体；但在实际工作中，由于不同的抗HCVELISA试剂盒生产厂家所使用HCV抗原的来源、质量及包被浓度各有差异，使得在测定中对同一份样本所测定的结果有时会出现很大的差异，尤其是对较弱阳性的样本或仅出现针对HCV单个蛋白成份的抗体的样本。,丙型肝炎病毒的分子生物学,HCV为一有包膜呈球形的正单链RNA病毒;HCV的基因组全长约9.4kb，由一过长的5非编码区（5-noncodingregion,5NCR）、大的约9033个核苷酸（nt）开放读码框架(openreadingframe,ORF)和一含poly（A）或poly（U）的3非编码区（3NCR）尾部三部份组成(图1),丙型肝炎病毒的分子生物学,丙型肝炎病毒的分子生物学,通常采用基因工程方法，表达上述结构和非结构区蛋白作为包被抗原来建立抗HCV检测的ELISA方法。HCV的5NCR的保守性最好，故RTPCR检测HCVRNA的引物设计多选用该区域。,丙型肝炎病毒的分子生物学,HCV为一具有很高变异率的不均一病毒株。其在复制过程中所依赖的RNA聚合酶为一容易产生错配倾向（error-prone）的RNA依赖的RNA聚合酶。同许多其它RNA病毒一样缺乏修补机制，使得不精确复制产物不能得到修补，从而出现较多的错配，表现出较高的变异率。多次复制和变异的结果将导致多种不同变异株的产生，表现为HCV株间的不均一性或差异性。,丙型肝炎病毒的分子生物学,JensBukh对所有的HCV序列比较和分析后认为：（1）HCV至少可分为9个主要基因型和30多个基因亚型；（2）各基因型间核酸水平的同源性为65.7%68.9%，各亚型间为76.9%80.1%，同亚型间为90.8%99.0%，符合基因分型原则；（3）已证实采用部份基因组区段和全基因组序列进行基因分型具有很好的一致性，但除E1和NS5b外，其它各区的代表性并不完全，因此建议E1和NS5b是将来进一步基因分型的最好选择片段；（4）在众多的基因分型方法中，均各有其优缺点，唯一可信而又可用于鉴定新的基因型的方法，就是选择特定的HCV基因区段特别是E1区进行测序分析。,丙型肝炎病毒的分子生物学,HCV基因型的分布有明显的地区差异。1型和2型呈广泛分布，1a和1b是北美、南美和欧州的主要株型，而1b是大多数亚州国家的主要株型；3型主要分布尼泊尔、泰国、英国、澳大利亚、芬兰及新西兰等国；4型是中北非州国家的主要株型；5型则是南非国家的主要株型；6型在香港和越南占重要比例；7、8、9型均从越南病例中发现。在我国以1b和2a为主要株型，其它基因型少见。,HCV感染的免疫应答的特点,（1）HCV作为单链RNA病毒，复制活性较低，感染过程中诱生、干扰素的能力弱于双链RNA病毒；（2）HCV的变异主要在包膜蛋白编码区，机体的免疫作用可加速这种选择性变异并很快在受染者体内出现准种及主要株型的转换，表现出多相免疫应答反应；（3）由于HCV核酸具有感染性，因此可阻止病毒在细胞间传播的抗体、干扰素对HCV核酸来说将无能为力；（4）HCV在感染者体内滴度较低，虽然能诱导免疫应答的产生，但在多数情况下可能不足以诱导有效的病毒清除反应。,机体对HCV感染的抗体应答,对非结构蛋白的抗体应答对衣壳蛋白的抗体应答对包膜蛋白的抗体应答（一般认为C区和NS4区蛋白能诱导机体较强的抗体应答）,对HCV非结构蛋白的抗体应答（1）,HCV的非结构蛋白编码区的产物NS2、NS3、NS4和NS5四种蛋白，除NS2外其它均能有效地诱导HCV感染者的抗体应答。抗NS3抗体的出现明显早于其它抗体，与抗NS4和NS5抗体不同的是，其可能是构象依赖性的，因为使用NS3的合成多肽不能检出相应的特异性抗体。而NS4区则含有至少两个免疫优势序列位点，抗原性较强，绝大多数HCV感染者能产生针对该区C1003的抗体反应。,对HCV非结构蛋白的抗体应答（2）,当HCV感染者抗NS3和抗NS4抗体阴性时，针对NS5区病毒RNA聚合酶的抗体反应可为阳性，并且其血清转换要早于其它抗原。在慢性HCV感染者中有79的病人出现对该区的抗体反应。由于NS5区的这些抗体应答特征，它已被用于第三代ELISAHCV诊断试剂中，试图增加诊断的敏感性和特异性。由于非结构蛋白均在细胞内产生，在细胞内即完成其生物学功能。因此，机体对这些蛋白产生的抗体无保护作用，除了作为HCV感染的指标外，其是否通过诸如免疫复合物、抗体依赖的细胞毒作用等方式参与HCV或缺陷颗粒的清除以及肝内、肝外组织免疫损伤过程尚不清楚。,对HCV衣壳蛋白的抗体应答,HCV衣壳蛋白含有至少两个主要位点，一是在523位氨基酸残基之间，另一在3974位之间，它能诱导HCV感染者产生较早、较持久的抗体应答。对该区抗体应答的生物学意义可能与人体对非结构蛋白抗体应答的意义相同。,对HCV包膜蛋白的抗体应答免疫保护与免疫逃避（1）,HCV的包膜糖蛋白具有高度的可变性，这种变异的根源在于HCV对机体免疫系统的作用所产生的免疫逃避。由于包膜蛋白快速变异导致的准种、多基因型以及基因型转换等产生的免疫逃避，使得人们难以确定抗包膜蛋白抗体是否即是HCV中和抗体。对HCVE1及E2区以及产物多肽的深入研究发现：该区编码的糖蛋白的变异不仅在HCV持续感染中起重要作用，同时也是诱导机体产生中和抗体的抗原决定簇所在部位。,对HCV包膜蛋白的抗体应答免疫保护与免疫逃避（2）,在包膜蛋白E2中有两个高变区（HVR）即HVR1和HVR2。因在HCV感染者中未测出HVR2多肽特异性抗体，因而认为其在HCV的体液免疫反应中不是一个主要抗原。而HVR1具有良好的抗原性，能有效的诱导机体的抗体应答。目前普遍认为针对HVR1区的抗体具有中和抗体的作用，但这种保护作用是有限的、暂时的、高度特异性的。,对HCV包膜蛋白的抗体应答免疫保护与免疫逃避（3）,因为HCV的免疫逃避使得HCV的基因型发生改变，进而改变抗原表型，以逃避机体特异性中和抗体的清除作用。新出现HCV株又刺激机体产生新一轮免疫反应，于是，在机体的免疫压力下，新HCV株又开始新一轮免疫逃避变异。循环往复，体现了HCV的免疫逃避和机体反逃避的相互作用。结果表现为HCV感染的持续存在。在免疫血清学上表现为在慢性HCV感染中有极高的特异性IgM抗体检出率。也是许多HCV感染者体内HVR1多肽抗体与HCV病毒血症并存的原因。,HCV感染的免疫测定,HCV感染的免疫测定最广泛的是抗HCV的检测，多采用ELISA方法筛检，重组免疫印迹试验（Recombinantimmunoblottingassay,RIBA）进行确认。抗HCVELISA和RIBA检测方法的建立的基础是HCV结构和非结构蛋白或多肽抗原重组表达及体外合成的成功，并经历了第一代、第二代和第三代试剂的发展过程。,用于抗HCVELISA测定的抗原,有两类，一类为基因工程重组抗原，其优点是覆盖抗原位点多，抗原抗体反应强，如C33C。另一类是合成肽抗原，其优点是易于纯化，试剂特异性较好，缺点是合成肽抗原由于分子量较小，缺乏空间构型决定簇，难免会造成漏检。,第一代抗HCV检测试剂,第一代抗HCV检测试剂是在1989年美国Chiron公司Choo等首先克隆的HCV基因组5-1-1片段的基础上建立的。他们将包括5-1-1在内的一个克隆（C-100）与编码人超氧化物歧化酶（Superoxidedismutase,SOD）的基因片段融合，在酵母细胞中表达了可用于检测抗HCV抗体的C100-3抗原，为C100与SOD的融合蛋白。1990年美国Ortho和Abbott公司用C100-3抗原生产了第一代抗HCVELISA试剂盒，并广泛应用于献血员的筛检及临床HCV感染的检测。,第一代抗HCVELISA诊断试剂的缺陷,（1）特异性不高。常发现有假阳性，部份是由于患者血清中存在针对融合蛋白中的SOD的抗体；类风湿因子（Rheumaticfactor,RF）阳性血清标本，也有很大一部份为抗C100-3抗体阳性。（2）灵敏度低。抗体检出时间晚，大多数病人在HCV感染46个月后才能产生抗C100-3抗体，有少数要到1年以上甚至始终不出现抗C100-3抗体。C100-3灵敏度低可能与HCV存在不同亚型以及C100-3只占HCV基因组编码蛋白的一小部份等因素有关。,第一代抗HCV的RIBA确认试剂,1990年Chiron/Ortho公司联合研制了第一代RIBA试剂作为抗HCV的确认试剂，其使用两种HCV抗原即C100-3和5-1-1分别固定在硝酸纤维素膜上。这两种抗原都是与SOD的融合蛋白。检测时，C100-3和5-1-1带均为阳性则判为阳性，其中之一为阳性则判为不确定，两者均阴性者判为阴性。,第二代抗HCVELISA检测试剂,随着对HCV研究的不断深入，HCV的特异性核心区抗原P22（C22）和NS3区抗原C33C表达成功，经与C100-3抗原对比检测发现，C22和C33C抗原的早期诊断能力均优于C100-3抗原，并提高了检测的灵敏度和特异性。于是以包被核心和NS3区抗原为主的第二代抗HCVELISA试剂盒应运而生，不同的厂家抗原的包被模式各有不同，主要有以下二种：（1）C22C33C；（2）C22和C200（C100C33C）。,第二代抗HCVRIBA试剂,第二代RIBA试剂（RIBA2）含有4种抗原成份，即C100-3、5-1-1、C33C（NS3区）和C223（C区）。第二代RIBA试剂增加了核心区和NS3区抗原，检测的敏感性和特异性较第一代RIBA有所提高。,第三代抗HCVELISA试剂,其改进主要有：（1）根据各种HCV抗原在检测中所起的作用及其诊断价值调整了各组份在试剂盒中的比例，优化了试剂盒的组装工艺。由于C33C无论是在抗HCV早期诊断及提高检测灵敏度上都有重要价值，而C22中的HCV核心N端保守区域易产生非特异性交叉反应，因此，在第三代试剂中，核心抗原比例相对下降，而相应增加了C33C的比例；（2）随着基因重组技术发展，对一些重要抗原采用更好的表达系统表达，对所采用的基因片段进行重新定位；利用各种先进的生产工艺，使原料抗原活性更强，增加了检测灵敏度，同时减小了非特异性；（3）发现了NS5区的血清学意义，增加NS5区抗原作为包被抗原。,第三代抗HCVRIBA试剂（RIBA3）,RIBA3所用抗原由核心区的C22、NS3区的C33C、NS4区的5-1-1和C100及NS5抗原组成，较之第二代试剂增加了NS5。RIBA阳性，可充分说明病人的感染性及肝病的存在。RIBA不确定结果有多种解释：（1）所有对RIBA2中的5-1-1、C1003或RIBA-3中的NS5的单独反应都代表假阳性；（2）RIBA2中核心及NS3的不确定结果可能代表真阳性，其结果可被灵敏度更高的确认实验或E2的gp70抗原检测所证实；（3）在免疫自限性的高危人群中，不确定的RIBA结果有较大差异，但其中绝大部份都有病毒血症及肝炎存在。,三代抗HCVELISA测定试剂的比较,试剂包被抗原窗口期敏感性特异性第一代C100334个月8090假阳性较高第二代C223、C33C812周90以上特异和C1003第三代C223、C33C610周95特异性更好和NS5,抗HCVELISA和RIBA诊断试剂的不足,在低危人群中仍发现大量的不确定和假阳性结果，再则仍有较长的“窗口期”。第三代试剂显著增加了NS3抗原成份，同时相应减少了核心区抗原成份，这在一定程度上提高了检测灵敏度及降低了低危人群的非特异反应。但是，核心区抗原的减少程度把握不好的话，有可能会导致漏检的发生。此外，由于这些试剂所使用HCV抗原只是病毒的部份重组多蛋白或合成肽抗原，加之，固相对这些蛋白或多肽的吸附能力的局限性，使得固相上能捕获抗体的抗原决定基的数量有限，从而影响测定的敏感性。,HCV融合蛋白研究进展,近来，美国Chiron公司构建表达了一个所谓的MEFA-6融合蛋白，其包含两拷贝的主要核心和NS5决定基、一个单拷贝主要E1和E2线性决定基和一个从NS4（5-1-1）衍生的单拷贝的基因型1、2和3特异的决定基，由于螺旋酶区具有很强的免疫原性，故又将大部份NS3区包含在内。这种融合蛋白囊括了HCV基因组7个功能区中的所有主要的免疫决定基（图2）。,MEFA-6融合蛋白与HCV基因组的关系,MEFA-6融合蛋白的优点,使用这种蛋白建立的抗HCV化学发光测定方法表现了很好的测定灵敏度和特异性，测定敏感性较使用NS3-NS4-核心（C25）区融合蛋白的免疫测定方法高24倍。这种融合蛋白的优点是:(1)增加了重组抗原上主要决定基的数量，同时减少了不必要的氨基酸的数量，这样就提高了暴露在外的决定基的比例；（2）重复性决定基序列的存在降低了由于抗原结合于固相所致的空间位阻；（3）MEFA抗原更容易纯化。大多数酵母和大肠杆菌细胞内蛋白非常难溶，而MEFA6蛋白主要含亲水性决定基，因此，较通常的重组多肽具有更好的可溶性，更易于纯化。,目前抗HCVELISA检测所存在的问题,目前抗HCV检测ELISA试剂盒均采用HCV的基因工程或合成多肽抗原（核心区、NS3、NS4和NS5等）包被固相，以间接法进行测定；由于上述HCV抗原的组合、来源及用量等方面的差异，可能会造成在临床上使用不同试剂生产厂家的ELISA试剂盒的测定结果出现较大的差异，漏检现象严重，用于献血员血液筛