生物化学DNA复制与修复PPT课件

.,1,DNA是绝大多数生物体遗传信息的载体，继1953年Watson&Crick提出DNA双螺旋结构模型后，1958年Crick提出了“中心法则”（Centraldogma）揭示了遗传信息的传递规律。,一、遗传的中心法则,.,2,在宿主细胞中一些RNA病毒能以自身的RNA为模板复制出新的病毒RNA，还有一些RNA病毒能以自身RNA为模板逆转录合成DNA。,遗传信息以密码的形式储存在DNA分子上，表现为特定的核苷酸排列顺序。在细胞分裂过程中，通过DNA的复制把亲代细胞的遗传信息传递给两个子代细胞。在子代细胞的生长发育过程中，这些遗传信息通过转录传递给RNA，再由RNA翻译转变成相应的蛋白质，由蛋白质执行各种各样的生物学功能，使后代表现出与亲代相似的遗传特征。,.,3,遗传的中心法则总结了生物体内遗传信息的流动规律揭示遗传的分子基础，不仅使人们对细胞的生长、发育、遗传和变异等生命现象有了更深刻的认识，而且以此为基础发展起来的基因工程，给人类的生产和生活带来了巨大的影响。,.,4,1、半保留复制DNA复制时，以亲代DNA的两条链分别作为模板，在DNA聚合酶的催化下，按碱基互补的原则合成两条与模板链互补的新链，组成新的DNA分子。新形成的两个DNA分子与亲代DNA分子的碱基顺序完全一样。由于子代DNA分子中一条链来自亲代，而另一条链是新合成的，因此这种复制方式称为半保留复制(semi-conservativereplication)。,二、DNA复制的特点,.,5,DNA半保留复制的实验依据,1958年Meselson&stahl，用同位素示踪标记加密度梯度离心技术实验证明了DNA是采取半保留的方式进行复制,15N培养基,14N培养基,14N培养基,.,6,1963年，Cairns用放射自显影的方法首次观察到完整的正在复制的大肠杆菌染色体DNA。将3H-胸苷标记大肠杆菌DNA近两代的时间，使3H-胸苷掺入大肠杆菌DNA中。然后用溶菌酶把细胞壁消化掉，使完整的大肠杆菌染色体DNA释放出来，再通过放射自显影，得到下图。非复制部分（C）银粒子密度较低，由一股放射性链和一股非放射性链构成。已复制部分站整个染色体的三分之二，其中一条双链（B）仅有一股链有标记，另外一股双链（A）的两股链都有标记，银粒子密度为前二者的两倍。,复制中的大肠杆菌染色体放射自显影图(Caims实验),C,A,B,.,7,2、有一定的复制起点基因组能独立进行复制的单位，称为复制子（replicon）。每个复制子都含有控制复制的起点（origin），可能还有复制终点（terminus）。DNA的复制是在起始阶段进行控制的，一旦复制开始，就延续到完成复制为止。原核生物中的复制起始点通常为一个，而真核生物中为多个。大肠杆菌的复制起点（oriC），由245bp构成，关键序列在于三个13bp的序列和四个9bp的序列。,大肠杆菌DNA复制起点成串排列的重复序列,.,8,3、需要引物DNA聚合酶必须以一段具有3端自由羟基（3-OH）的RNA作为引物(primer)，才能开始合成子代DNA链。RNA引物的大小，在原核生物中通常为50100个核苷酸，而在真核生物中约为10个核苷酸。RNA引物的碱基顺序，与其模板DNA的碱基顺序相配对。,.,9,4、多为双向复制双向复制：多数复制从起始点向2个方向进行复制，有2个复制叉。单向复制：少数复制从起始点向1个方向进行复制，只有1个复制叉。,DNA双向复制：在复制过程结束前加入3H，通过放射自显影观察标记（红色），判断复制是双向还是单向。,.,10,3H标记大肠杆菌DNA结果表明两条链是同时复制的（红色表示新合成的链），电镜下观察到的复制过程，正好与放射自显影上所显示的相符。,DNA双向复制可视图二：,.,11,5、半不连续复制由于DNA聚合酶只能以53方向聚合子代DNA链，即模板DNA链的方向必须为35。因此，分别以两条亲代DNA链作为模板聚合子代DNA链时的方式是不同的。,(leadingstrand),(laggingstrand),.,12,以35方向的亲代DNA链作模板的子链，在复制时连续合成，子链的聚合方向为53，这一条新合成的子链被称为前导链(leadingstrand)或领头链。,以53方向的亲代DNA链为模板，合成子链的过程不连续，这条链被称为随从链(laggingstrand)或滞后链。,.,13,DNA双链在复制时逐步解开，因此随从链的合成是一段一段的。DNA在复制时，由随从链所形成的一些子代DNA短链称为冈崎片段(Okazakifragment)。冈崎片段长度，在原核生物中约为10002000个核苷酸，而真核生物中约为100200个核苷酸。,.,14,1、半保留复制2、有一定的复制起点3、引物4、双向复制5、半不连续复制,DNA复制的特点,.,15,三、DNA复制的条件,1、底物以四种脱氧核糖核酸(deoxynucleotidetriphosphate)为底物，即dATP，dGTP，dCTP，dTTP。(dNMP)n+dNTP(dNMP)n+1+PPi,2、模板(template)DNA复制是模板依赖性的，必须以亲代DNA链作为模板。亲代DNA的两股链解开后，可分别作为模板进行复制。,.,16,.,17,3、拓扑异构酶,除连环数不同外其他性质均相同的DNA分子称为拓扑异构体（topologicalisomers），引起拓扑异构反应的酶称为拓扑异构酶（topoisomerase）。拓扑异构酶：能使DNA的一条链发生断裂和再连接，反应无需供给能量。拓扑异构酶：能使DNA的两条链发生断裂和再连接，引入超螺旋时需要ATP供给能量。,原核生物的拓扑异构酶引入负超螺旋，而拓扑异构酶可减少负超螺旋。真核生物略有不同，但均在协同作用下控制着DNA的拓扑结构。,.,18,4、解链酶和单链DNA结合蛋白,2.单链DNA结合蛋白（single-strandbindingprotein,SSB）:是一些能够与单链DNA结合的蛋白质因子。,作用：稳定单链DNA，阻止DNA复性，避免被核酸酶降解，便于复制子代DNA。,1.解链酶（helicase，解螺旋酶）：断裂互补碱基间的氢键，使DNA双链分离形成“复制叉”。,.,19,5、引发体和RNA引物引发体（primosome）：由引发前体与引物酶（primase）组装而成（解螺旋酶、引物和引物酶）。引发前体：由若干蛋白因子聚合而成的复合体。在原核生物中，引发前体至少由六种蛋白因子构成。,引物酶：是一种依赖DNA的RNA聚合酶（DDRP），该酶以DNA为模板，聚合一段RNA短链引物（primer），以提供自由的3-OH，使子代DNA链能够开始聚合。,.,20,6、DNA聚合酶,DNA聚合酶种类：原核生物中，DNA聚合酶至少有五种，分别命名为DNA聚合酶、DNA聚合酶、DNA聚合酶、DNA聚合酶、DNA聚合酶。真核生物中，目前发现的DNA聚合酶有五种，分别命名为DNA聚合酶、DNA聚合酶、DNA聚合酶、DNA聚合酶、DNA聚合酶。,.,21,DNA聚合酶（pol）：是由单一肽链组成的大分子蛋白质，可被特异的蛋白酶水解为两个片段，其中的大片段称为Klenowfragment，具有53聚合酶活性和35外切酶活性。,DNA聚合酶生理功能：,原核生物,.,22,DNA聚合酶（pol）：多个亚基组成，其中亚基具有53聚合酶活性，因而具有复制DNA的功能；而亚基具有35外切酶的活性，因此它与DNA复制的校对功能有关。亚基为依赖DNA的ATP酶,DNA聚合酶（pol）：为多亚基酶，其聚合酶亚基有一条多肽链组成，酶活力比DNA聚合酶高。除53聚合酶活性外，还具有35外切酶活性，但无53外切酶活性。DNA聚合酶不是复制酶，而是修复酶。,.,23,DNA聚合酶和：1999年才被发现，涉及DNA的错误倾向修复（errorpronerepair）。当DNA受到较严重损伤时，即可诱导产生这两种酶进行修复，但修复缺乏准确性，因而出现高突变率。高突变率虽然会杀死许多细胞，但至少可以克服复制障碍，使少数突变的细胞得以生存。,.,24,真核生物DNA聚合酶（pol）：参与染色体DNA复制（延长随从链）DNA聚合酶（pol）：在其他聚合酶无活性时才发挥作用DNA聚合酶（pol）：参与线粒体DNA复制DNA聚合酶（pol）：参与染色体DNA复制（延长前导链）DNA聚合酶（pol）：与DNA损伤修复、校正和填补缺口有关,.,25,原核生物中三种DNA聚合酶的性质比较,.,26,真核生物中DNA聚合酶的性质比较,.,27,DNA复制的忠实性：DNA复制过程是一个高度精确的过程，据估计，大肠杆菌DNA复制1091010个碱基才出现一个误差（体外的错配率1/104105）。对有4.6106个碱基对的大肠杆菌染色体来说，这意味着每进行100010000次复制才出现一次错误。保证复制忠实性的原因主要有以下三点:1DNA聚合酶的高度专一性：严格遵循碱基配对原则（错配率为710-6）2DNA聚合酶的校对功能：错配碱基被DNA聚合酶的35外切酶活力切除3.起始时以RNA作为引物,.,28,为什么RNA作为引物，能够保证DNA聚合过程的高度精确？,.,29,DNA聚合酶具有35外切酶功能，以校正复制过程中的核苷酸，也就是说聚合酶在开始形成一个新的磷酸二酯键前，总是检查前一个碱基是否正确，这也决定了DNA复制不能从头开始合成。因此，先合成一条低忠实性的多核苷酸来开始DNA的合成，并以核糖核苷酸来表示是“暂时”的，当DNA开始聚合以后再利用53外切酶的功能进行切除，确保复制的忠实性。,.,30,7、DNA连接酶,催化双链DNA切口处的5-磷酸基和3-羟基生成磷酸二酯键，使两段DNA连接起来。,DNA连接酶（DNAligase）：,.,31,作用顺序,DNA复制酶系,四、DNA复制的过程,.,32,大肠杆菌的DNA复制复制的起始DNA复制起始位点：大肠杆菌的复制起点由245bp构成，其中有3个13bp和4个9bp的关键序列,DnaA蛋白（20-40）ATP结合位点,DnaB(解螺旋酶),SSB,大肠杆菌DNA复制起点起始阶段的结构模型,DNA,.,33,解旋解链，形成复制叉：由拓扑异构酶和解链酶作用，使DNA的超螺旋及双螺旋结构解开，碱基间氢键断裂，形成两条单链DNA。单链DNA结合蛋白（SSB）结合在两条单链DNA上，形成复制叉。,.,34,组装引发体：由蛋白因子（如dnaB等）识别复制起始点，并与其他蛋白因子以及引物酶一起组装形成引发体（解螺旋酶、引物和引物酶）。引发：在引物酶（RNA聚合酶）的催化下，以DNA为模板，合成一段短的RNA片段，从而获得3端自由羟基（3-OH）。,.,35,2.复制的延长DNA聚合酶，以35方向的亲代DNA链为模板，从53方向聚合子代DNA链。在原核生物中，参与DNA复制延长的是DNA聚合酶；而在真核生物中，是DNA聚合酶（延长随从链）和（延长领头链）。,.,36,引发体向前移动，解开新的局部双螺旋，形成新的复制叉，随从链重新合成RNA引物，继续进行链的延长。,.,37,复制叉2,复制叉1,终止复制叉2,终止复制叉1,复制叉1,复制叉2,完成复制,DNA拓扑异构酶IV,连锁染色体,3.复制的终止,复制的最后两个复制叉在终止区域相遇，这个区域有20个碱基对序列组成，叫Ter序列(terminus)。Ter序列的功能是结合一种叫Tus的蛋白质。而Ter-Tus复合体能抑制前进的复制叉，使复制停止。DNA拓扑异构酶IV使复制的DNA分开。,.,38,去除引物，填补缺口：原核生物，由DNA聚合酶来水解去除RNA引物，并由该酶催化延长引物缺口处的DNA，直到剩下最后一个磷酸酯键的缺口。而真核生物的RNA引物，由一种特殊的核酸酶来水解，冈崎片段仍由DNA聚合酶来延长。,.,39,连接冈崎片段：在DNA连接酶的催化下，形成最后一个磷酸酯键，将冈崎片段连接起来，形成完整的DNA长链。,.,40,4.真核生物端粒的形成：端粒（telomere）：指真核生物染色体线性DNA分子末端的结构部分，通常膨大成粒状。其共同的结构特征是由一些富含G、C的短重复序列构成，可重复数十次至数百次。人端粒DNA由53方向的（TTAGGG）n反复串联组成，长约515kb，是非结构基因，不具编码蛋白质的功能。,.,41,端粒酶（telomerase）：端粒酶是一种RNA-蛋白质复合体，它以自身RNA为模板，通过逆转录过程对末端DNA链进行延长。线性DNA在复制完成后，其末端由于引物RNA的水解而可能出现缩短。故需要在端粒酶的催化下，进行延长反应。,.,42,五、DNA的损伤与修复,1、DNA的损伤（突变）DNA在复制过程和复制结束后都能引起DNA的损伤。自发的或环境的因素引起DNA一级结构的任何异常改变称为DNA的损伤，也称为突变（mutation）常见的DNA的损伤包括碱基脱落、碱基修饰、交联，链的断裂和重组等。,原因：生物因素，物理因素，化学因素来源：细胞内部，细胞外部部位：DNA的碱基，糖，磷酸二酯键,.,43,（一）引起突变的因素：1自发因素：(1)自发脱碱基：由于N-糖苷键的自发断裂，引起嘌呤或嘧啶碱基的脱落。每日可达近万个核苷酸残基。(2)自发脱氨基：胞嘧啶自发脱氨基可生成尿嘧啶（CA），腺嘌呤自发脱氨基可生成次黄嘌呤（AI）。每日可达几十到几百个核苷酸残基。(3)复制错配：由于复制时碱基配对错误引起的损伤，发生频率较低。,.,44,2物理因素：由紫外线、电离辐射、X射线等引起的DNA损伤。其中，X射线和电离辐射常常引起DNA链的断裂，而紫外线常常引起嘧啶二聚体的形成，如TT，TC，CC等二聚体。这些嘧啶二聚体由于形成了共价键连接的环丁烷结构，因而会引起复制障碍。,.,45,3化学因素：(1)脱氨剂：如亚硝酸与亚硝酸盐，可加速C脱氨基生成U，A脱氨基生成I。(2)烷基化剂：这是一类带有活性烷基的化合物，可提供甲基或其他烷基，引起碱基或磷酸基的烷基化，甚至可引起邻近碱基的交联。(3)DNA加合剂：如苯并芘，在体内代谢后生成四羟苯并芘，与嘌呤共价结合引起损伤。(4)碱基类似物：如5-FU，5-BU等，可掺入到DNA分子中引起损伤或突变。,(5)断链剂：如过氧化物，含巯基化合物等，可引起DNA链的断裂。,.,46,（二）DNA突变的类型：,.,47,（三）DNA突变的效应：1同义突变：基因突变导致mRNA密码子第三位碱基的改变，但不引起密码子意义的改变，其翻译产物中的氨基酸残基顺序不变，但有时可引起翻译效率降低。2误义突变：基因突变导致mRNA密码子碱基被置换，翻译产物中的氨基酸残基顺序发生改变。3无义突变：基因突变导致mRNA密码子碱基被置换而改变成终止密码子，引起多肽链合成的终止。4移码突变：基因突变导致mRNA密码子碱基被置换，引起突变点之后的氨基酸残基顺序全部发生改变。,.,48,2、DNA损伤的修复,DNA损伤的修复：可分为直接修复和取代修复两大类。,.,49,（一）直接修复：1光复活（lightrepairing）：这是一种广泛存在的修复作用。光复活能够修复任何嘧啶二聚体的损伤。其修复过程：光复活酶（photo-lyase）识别嘧啶二聚体并与之结合形成复合物在300600nm可见光照射下，酶获得能量，将嘧啶二聚体的丁酰环打开，使之完全修复光复活酶从DN