分子生物学实验技巧

限制性内切酶基础知识限制性内切酶 限制性内切酶基础知识 限制性内切酶关键注意事项 限制性内切酶疑难解决指南 限制性内切酶在基因组作图与分析中的应用如果没有限制性内切酶，当今的分子生物学研究会是个什么样子？40年来，限制性内切酶这个幕后成员默默推动着许多基础生物学研究和商业化应用 。限制性内切酶（又称限制酶）首先是在细菌体内发现的，但后来在部分古细菌中也发现了这种成分。通常，限制性内切酶会切割双链 DNA。每个限制性内切酶会识别特定的 DNA 序列，根据不同的内切酶类型，可在识别序列内或距识别序列不远的位置处切割 DNA。识别序列长度通常为 4 - 8 bp，酶切之后会形成粘性末端（5 或 3 突出端）和平末端（图 1）。图 1.特定限制性内切酶切割后形成的粘性或平末端（5 或 3 端）示意图。如今业内已经鉴定了大约 4000 种限制性内切酶，其中超过 600种 可商业化供应。REBASE是一个非常有用的资源库，可查询限制性内切酶全面信息及更新信息，包括限制性内切酶的特异性、灵敏度和商业化来源等1。本页内容： 限制性内切酶发展史 许多克隆含有空载体 限制性内切酶分类 识别位点和酶切特异性 参考文献限制性内切酶发展史上世纪 50 年代初期，许多研究团队观测到了噬菌体对于同一物种的不同细菌宿主菌株存在感染效率差异2,3。Grasso 和 Paigen 对此的描述如下：使用在一种细菌菌株（例如，大肠杆菌C）内繁殖的噬菌体 感染同一种类的另一菌株（例如，大肠杆菌K），结果发现，相比于重新感染宿主菌株（大肠杆菌C），大肠杆菌 K 的感染率出现明显下降。新的宿主（大肠杆菌K）似乎可以选择性抵御或“耐受”侵入的噬菌体。研究人员还发现，这一现象并没有遗传性，因为经过一轮感染后，在新菌株中生长的噬菌体还可以以正常的感染率感染该菌株。这种现象被称为“宿主控制变异”，有关其背后的机制也成为了频繁研究的领域4。直到上世纪 60 年代，人们才发现宿主控制变异的机制，其与噬菌体 DNA 的酶切有关，进而发现并分离出了限制性内切酶。上世纪 60 年代初 Werner Arber 观测发现，宿主范围的决定性遗传物质都存在于噬菌体 DNA之中，而后续实验证明甲硫氨酸参与宿主的自我保护5。这些发现最终催生了限制性修饰 (R-M) 体系的概念，通过该体系，来自于宿主的限制性内切酶和甲基化酶共同作用，切割外来病毒（非甲基化） DNA，同时保护宿主的 DNA 不受甲基化6。颇为有趣的是，大多数 R-M 体系的早期研究工作围绕限制性内切酶的 Type I 和 Type III 基团进行，该分类方法主要依据限制性内切酶的结构和功能（参见限制性内切酶分类）。然而在 Kent Wilcox 和 Hamilton Smith 发现第一种 Type II 级限制性内切酶 HindII 之前，限制性内切酶显然还未得到充分利用7。HindII 能够识别特定的对称 DNA 序列，按照精确的方式切割识别序列内的位点。此功能（大多数早期 Type II 限制性内切酶均发现存在此功能）促使 Kathleen Danna 和 Daniel Nathans 使用 HindII 研究猿猴空泡病毒 40 DNA物理图谱8，即所谓的限制性内切酶图谱。凭借在限制性内切酶方面的开创性研究，Daniel Nathans、Hamilton Smith 和 Werner Arber 共同获得 1978 诺贝尔生理学或医学奖。随着 DNA 连接酶的发现以及位点特异性限制性内切酶家族不断壮大，重组 DNA 技术应运而生。回到顶部限制性内切酶命名规则该命名规则综合考虑到内切酶来源的三种特性属名、种名和菌株或血清型组成了一个简短的名称，后面加上罗马数字，代表来自同一菌株的多个限制性内切酶9。例如，HindIII 酶（或者按照早期命名规则命名为Hind III）代表： “H”代表Haemophilus “in”代表influenzae “d”代表血清型d “III”用于区分来自于Haemophilusinfluenza血清型d的其它限制性内切酶（例如， HindII 和 HindIII）。回到顶部限制性内切酶分类根据结构的复杂程度、识别序列、切割位点位置以及辅助因子要求，限制性内切酶分为四类。表 1汇总了各类内切酶的区分特点表 1.限制性内切酶类别和特性。内切酶类别特点Type I 同时具有限制性和甲基化活性的多亚基蛋白 需要ATP 切割位点与识别位点间的间距不定Type II 特异性的识别序列 切割位点位于识别序列内或邻近识别序列 在切割位点生成 5 磷酸基和 3 羟基末端 需要 Mg2+Type III 由两个相反方向的识别序列组成 切割位点与其中一个识别序列的间距恒定 需要ATPType IV 仅切割甲基化的 DNA 切割位点大约距离识别位点 30 bp由于自身特殊的特点， Type II 限制性内切酶已经成为分子克隆、法医学 DNA 分析等许多研究应用最常用的限制性内切酶。这类内切酶的特殊切割方式使其得以应用在限制性片段长度多态性 (RFLP)分析，而后者也是法医学研究的基础。连接酶可酶促连接 DNA 末端的 5 磷酸基和 3 羟基，从而使得DNA可以通过限制性内切酶产生的5 磷酸基和 3 羟基末端进行重排和连接这也是重组 DNA 技术的基本原理。由于在分子生物学研究方面很有用处，Type II 限制性内切酶成为了研究最多的酶类别，其成为了最大的内切酶类别。目前经过鉴定的 Type II 限制性内切酶超过 3,500 种，这些酶又被进一步细分成 Type IIP、IIA、IIB、IIC、IIS 等子类别其中的 Type IIP 酶可识别回文（对称）靶标序列，是最流行的商业化限制性内切酶10。回到顶部识别位点和切割特异性另一个将限制性内切酶进行分类和比较的重要方法是同裂酶和异裂酶。 同裂酶是具有相同识别序列及相同特异性的限制性内切酶。例如，AgeI 和 BshT1 可通过相同的图谱识别和切割 5-ACCGGT-3。但一系列同裂酶可能在首选位点、反应条件、甲基化敏感度和星号活性方面存在差异。 异裂酶可以识别相同的核苷酸序列，但会在不同的位点切割 DNA。例如，异裂酶 SmaI (5-CCCGGG-3) 和 XmaI (5-CCCGGG-3)均可识别 5-CCCGGG-3 但切割方式不同，因而产生不同类型的末端（此时，SmaI 产生平端，而 XmaI 产生 5 突出末端）。识别序列和切割图谱方面的不同使限制性内切酶成为极其灵活、强大的基因材料鉴定和操作工具。回到顶部参考文献1. Roberts RJ, Vincze T, Posfai J, Macelis D (2015) REBASEa database for DNA restriction and modification: enzymes, genes and genomes.Nucleic Acids Res43:D298D299.2. Luria SE, Human ML (1952) A nonhereditary, host-induced variation of bacterial viruses.J Bacteriol64:557569.3. Bertani G, Weigl, JJ (1953) Host controlled variation in bacterial viruses.J Bacteriol65:112121.4. Grasso RJ, Paigen K (1968) Loss of host-controlled restriction of bacteriophage in Escherichia coli following methionine deprivation.J Virol2:13681373.5. Arber W (1965) Host specificity of DNA produced by Escherichia coli V. The role of methionine in the production of host specificity.J Mol Biol11:247256.6. Arber W (1965) Host-controlled modification of bacteriophage.Annu Rev Microbiol19:365378.7. Kelly TJ, Smith HO (1970) A restriction enzyme from Hemophilus influenzae II.J Mol Biol51:393409.8. Danna K, Nathans D (1971) Specific cleavage of simian virus 40 DNA by restriction endonuclease from Hemophilus influenza.Proc Natl Acad Sci USA68:29132917.9. Smith, HO, Nathans D (1973) Letter: a suggested nomenclature for bacterial host modification and restriction systems and their enzymes.J Mol Biol81:419423.10. Pingoud A, Wilson GG, Wende W (2014) Type II Restriction Endonucleases a Historical Perspective and More.Nucleic Acids Res42:74897527.限制性内切酶关键注意事项限制性内切酶 限制性内切酶基础知识 限制性内切酶关键注意事项 限制性内切酶疑难解决指南 限制性内切酶在基因组作图与分析中的应用限制性内切酶一般反应条件当进行限制性酶切反应时，为确保最佳的反应条件，务必要遵守限制性内切酶供应商提供的建议。在此过程中需要考虑的重要参数包括：底物 (DNA) 和酶的量、反应体积以及孵育时间。根据传统的定义，在最佳反应条件下，一个单位的限制性内切酶可以在1小时内，在 50 L体系中 完全酶切 1 L 定义底物（例如，质粒 pUC19）。尽管单位定义提供了一种测定方式，但还需注意，根据 DNA 底物之中的识别序列出现的频率及所用底物类型，针对不同DNA底物使用等量的限制性内切酶可能需要不同的最佳反应条件。实际上，酶供应商往往根据 DNA 样本的潜在质量、数量和性质波动，推荐比完全酶切所需量多 5 至 20 倍的酶（或 1 L 酶/反应体积）。为确保限制性内切酶的有效活性，应按照制造商的建议妥善存储并在过期前使用。通常情况下，应将酶分成小等份，存储在 20C 条件下的无霜冰箱之中，从而在维持活性的同时最大限度避免反复冻融。DNA 样本应避免接触可能抑制酶并造成其它负面效应的污染物，如核酸酶、盐、有机溶剂（例如，苯酚、氯仿或乙醇）以及洗涤剂。为避免在 20C 条件下结冰，限制性内切酶往往采用 50% 的甘油溶液形式提供。但甘油自身的粘度可能导致反应配制阶段移液和少量酶加样较为困难。最好是最后添加酶至终体积，添加之后就充分混匀。“用手指轻弹反应管”轻柔混匀，然后短暂离心反应管，可帮助酶在反应混合物中充分扩散，并在反应管底部收集到反应溶液。在孵育过程中，反应须达到所需的温度，并在整个孵育期间保持恒定。如果使用 5-15分钟完全酶切的快速限制性内切酶代替1小时酶切的传统限制性内切酶时，这一点尤为重要。须格外谨慎地密封反应管以避免样本蒸发，否则可能造成孵育时间延长（例如，延长至1 小时）和体积减少（例如，减少至5%）、低浓度盐、非最佳 pH、存在有机溶剂，以及除 Mg2+之外的二价阳离子都可能造成底物 DNA 的非特异性切割。使用酶制造商推荐的实验方案和缓冲液，可避免出现星号活性。回到顶部不完全酶切不完全酶切是在限制性内切酶使用过程中常遇到的问题之一。当酶量过多或过少时，都可能发生不完全酶切。DNA 样本中存在污染物也可能导致不完全酶切。缓冲液组分、孵育时间和反应温度等欠佳的反应条件是不完全酶切的常见原因。部分限制性内切酶需要辅因子才能实现完全活性。例如，Esp3I (BsmBI) 需要 DTT，而 Eco57I (AcuI) 需要 S-腺苷甲硫胺酸。AarI 和 BveI (BspMI) 等部分限制性内切酶需要两个拷贝的识别位点才能实现有效切割；针对这一类酶，通常向反应物之中添加一份带有识别位点的寡核苷酸来增强酶活性。除了反应条件和酶性质外，DNA 自身的性质也会影响限制性酶切（表 1）。甲基化的 DNA 可耐受部分限制性内切酶的切割（详见甲基化部分）。酶的识别位点过于接近终端（线性底物 DNA 中）以及切割位点相邻（双酶切）都可能影响酶切割 DNA 的效率）。此外，部分超螺旋 DNA 分子要比线性 DNA 分子更难切割，增加 5-10 倍的酶量可有助实现完全酶切。表 1.不完全酶切的常见原因。反应条件酶要求底物 DNA 条件 酶量过少 底物过多 pH 条件欠佳 温度欠佳 孵育时间过短 辅助因子 识别序列要求 首选位点 甲基化 限制性位点邻近 结构酶供应商在产品说明书中提供了使用建议，为实现完全酶切，必须严格遵守此类建议。（回到顶部）预料之外的切割图谱即便遵守了制造商的使用说明，仍可能观察到预料之外的底物 DNA 切割结果。为避免陷入此类困境，必须确保酶和 DNA、反应所用的试剂均不含污染物（例如，其它限制性内切酶、DNA 和核酸酶）。出现预料之外切割的一个原因是，在增殖和扩增过程中，底物 DNA 引入了突变。突变可能破坏已知的识别位点或创造出新的识别位点，从而产生预料之外的酶切结果。对 DNA 进行Sanger 测序，是一种判断突变是否引起底物 DNA 出现预期外切割的有效方法。有时候预期之外的酶切图谱是由检测过程而非酶切过程造成的。部分限制性内切酶（例如，FokI，TauI）可能会与 DNA 紧密结合，导致电泳时出现明显的凝胶迁移。使用含 SDS 的上样染料，加热使酶从切割的 DNA 上解离开来，均可避免出现这类凝胶迁移现象（图 2）。图 2.限制性内切酶与 DNA 结合可能导致电泳时条带拖尾。星号活性和不完全酶切也会导致凝胶电泳时出现预料外的条带。因此，进行问题排除时必须区别这两种因素。一种区分方法是根据孵育时间。如果为星号活性，孵育时间越长，不理想条带通常越容易区分，而不完全酶切的不理想条带则会随着孵育时间延长而消失。此外，不理想条带的大小也是一种区分方式。部分源于星号活性的条带会比预期条带低，而不完全酶切的条带会高于最低预期条带（图 3）。图 3.不完全酶切和星号活性的区分。（回到顶部）甲基化DNA 甲基化是真核和原核生物最常见的 DNA 修饰类型之一。在细菌体内，DNA 甲基化参与防御噬菌体感染的限制性修饰 (R-M) 防御系统（参见限制性内切酶基础知识），即保护宿主细菌自身的 DNA 不受内源性限制性酶切割。甲基化通常发生在胞嘧啶 (C) 和腺嘌呤 (A) 碱基处，主要形成 5-甲基胞嘧啶 (m5C)、N4-甲基胞嘧啶 (m4C) 和 N6-甲基腺嘌呤 (m6A) 衍生物。DNA 甲基转移酶可将来自供体的甲基基团转移到受体甲基（例如，A和C）上，催化甲基化反应。在实验室细菌菌株之中最常见的 DNA 甲基转移酶类型包括： Dam：代表脱氧腺苷甲基转移酶，可以将序列 5-GATC-3 转化为 5-G(m6A)TC-3 Dcm：代表脱氧胞嘧啶甲基转移酶，可以将序列 5-CCWGG-3 转化为 5-C(m5C)WGG-3（其中 W 代表 A或T） EcoKI：代表大肠杆菌K12 菌株内的 Type I R-M 体系，可以修饰序列 5-AAC(N)6GTGC-3 内的腺苷 EcoBI：代表大肠杆菌B 菌株内的 Type I R-M 体系，可以修饰序列 5-TGA(N)8TGCT-3 内的腺苷在哺乳动物和植物系统中，CpG 或 CpNpG 甲基化是生物进程中常见的 DNA 修饰，因而成为了表观遗传学的主要焦点。限制性内切酶对于甲基化 DNA 识别位点的敏感度因酶的种类而异。例如，如图 4所示，GATC 处的 Dam 甲基化完全阻断了 MboI，但是激活了 DpnI。而 5-CCGG-3 的 CpG 甲基化阻断了 HpaII 活性，但却对 MspI 没有任何影响。在部分情况下，限制性内切酶的活性会受甲基化部分抑制（例如， XhoI）。图 4.限制性内切酶对于底物 DNA 甲基化的敏感程度存在不同程度的差异。在细菌内增殖质粒时，必须考虑到目标限制性内切酶甲基化的影响。为防止在 5-GATC-3 和 5-CCWGG-3 位点发生甲基化，质粒转化应选择缺少 Dam 和 Dcm 甲基化酶的感受态细胞 (dam/dcm) 。大多数大肠杆菌细胞不含 CpG 甲基化系统，因而从细菌分离的 DNA 不存在 CpG 甲基化问题。如果基因组 DNA 提取自植物和哺乳动物，则可能在 CpG 位点发生甲基化，再通过部分甲基化敏感的酶影响限制性酶切。（回到顶部）质量/使用寿命在选择限制性内切酶时，一个往往被忽略的因素是供应商的生产条例和质量流程。为获得可靠的结果并最大限度避免各次实验运行间结果波动，研究人员应了解酶供应商生产这类产品时采取的质控和质量保证措施。购买此类酶时应考虑的几个关键问题包括： 制造商的履历和资质如何？他们在限制性内切酶研究和开发方面是否具有长期良好的声誉和成就？ 酶应该来自可靠的来源，才能获得一致的结果。 该类酶如何生产？认证的生产地点是否符合各种国际质量标准，如 ISO 9001 和无菌室环境？ 确保酶产品可靠，最大限度避免批次间差异非常重要。 制造商的产能如何？针对大规模实验，他们能否提供大批量生产和定制包装？ 对于全基因组或高通量研究，稳定的大规模和定制生产很重要。 酶的性能如何？接受过哪些测试？他们的活性、纯度和应用是如何测定的？这些测试是否足够灵敏，足以确保符合您的实验要求？ 提供质量控制文档是质量保证的一个重要措施。 供应商提供的知识广度和深度如何？存在有关酶的疑问或产品相关的问题时，供应商是否积极提供了有益的支持？ 深入理解产品和实时提供支持，是供应商行使合作伙伴职能的关键。总之，并不是所有的限制性内切酶都是一样的。生产这类重要且关键的工具时所遵循的生产条例、质量控制和质量保证措施，是确保您的实验成功的关键，因此需要谨慎考虑。（回到顶部）资源相关产品 限制性内切酶 DNA 修饰酶 感受态细胞限制性内切酶疑难解决指南限制性内切酶 限制性内切酶基础知识 限制性内切酶关键注意事项 限制性内切酶疑难解决指南 限制性内切酶在基因组作图与分析中的应用当使用电泳观察酶切结果时，您可能会观察到一些酶切问题，如： 不完全酶切或未酶切 意外的酶切图谱 DNA 条带弥散您可在此了解引起这些问题的可能原因以及我们对于解决这些问题的建议。另请参见限制性内切酶关键注意事项限制性酶切相关问题不完全酶切或未酶切可能原因建议酶失活 查看酶的过期日期 确保酶的储存温度为 20C。低于该温度，酶可能会冻结，从而引起失活。 避免反复冻融（不超过三次）。使用桌面冷冻盒存储和转移酶。 不要将酶储存于无霜冰箱或冷冻柜架上。酶切方案欠佳 遵循生产商对于限制性内切酶和底物 DNA 类型的推荐实验方案。 确保所有添加剂或辅酶因子（如DTT、Mg2+、ATP、S腺苷甲硫胺酸）添加至反应体系中。一些限制性内切酶需要添加这些添加剂或辅酶因子才能表现出活性（例如，Esp3I 需要 DTT）。 使用推荐的和酶配套的反应缓冲液。对于双酶切，请遵循生产厂家对于缓冲液兼容性以及其它反应条件的建议。 按照制造商指定的最优温度进行反应。如果使用需要不同酶切温度的酶来进行双酶切，则需要先完成低温酶切，再进行第二次更高温度的酶切。 确保在孵育过程中，反应体积不会因蒸发而减少，从而导致盐浓度的升高，进而降低酶的活性。对于嗜热的酶来说，请使用带有加热盖的热循环仪。内切酶稀释不当 避免小体积(0.5 L)加样。可通过配制更大体积的工作储存液，从而保证加入每个反应的酶量准确。 使用制造商推荐的稀释缓冲液配制工作储存液。 不要在水或者 10X 反应缓冲液中稀释限制性内切酶。反应体系配制不当 最后一步向反应体系中加入限制性内切酶。加入酶后，轻弹或混合反应管，以确保酶没有由于甘油密度的原因沉降在管底部。反应混合液中存在过多的甘油 保持甘油在反应混合液中的浓度为5%)和盐浓度升高。其他酶引起的污染 使用一管新的酶或缓冲液。由于处理不当，限制性内切酶或反应缓冲液可能被其他限制性内切酶污染。其它底物 DNA 污染 制备一份新的 DNA 样本。DNA 迁移变慢（凝胶迁移） 在电泳前，在含有 0.2 SDS 的上样缓冲液中，将经酶切的DNA在 65 下加热10 分钟。这一过程可将任何可能仍与底物 DNA 结合的酶解离下来，从而改善 DNA 的电泳迁移率。底物 DNA 中存在意料之外的识别序列 重新检查克隆策略和连接位点。DNA 结构中新产生的酶切位点可能被忽略。 通过 Sanger 测序确认 DNA 序列的完整性。突变可能已经改变了模板上的酶切位点。重新增殖质粒，或用高保真DNA 聚合酶扩增原始靶序列。 甲基化可能影响限制性内切酶的切割（例如，MboI能被甲基化抑制，但DpnI却能被活化）。请参阅不完全酶切或无酶切中有关甲基化影响的建议。回到顶部DNA 条带弥散DNA 条带弥散可能原因建议DNA 质量差 通过电泳检测未酶切的 DNA。如果在凝胶上观察到拖尾（降解）现象，则应重新纯化 DNA。试剂污染 重新制备试剂，使用新的酶，或根据需要对 DNA 再次进行纯化。反应组分可能在不恰当的操作中被核酸酶污染。DNA 迁移变慢（凝胶迁移） 在电泳前，在含有 0.2 SDS 的上样缓冲液中，将经酶切的DNA在 65 下加热10 分钟。这一过程可将任何可能仍与底物 DNA 结合的酶解离下来，从而改善 DNA 的电泳迁移率。限制性内切酶在基因组作图与分析中的应用限制性内切酶 限制性内切酶基础知识 限制性内切酶关键注意事项 限制性内切酶疑难解决指南 限制性内切酶在基因组作图与分析中的应用尽管限制性内切酶广泛应用于分子克隆，但它还作为分子工具还可应用于分子生物学的其它应用。其中两大重要应用为 DNA指纹识别和甲基化分析，这二者是基因组作图、分析表观遗传学图谱的主要方法。 DNA 指纹识别 甲基化分析使用限制性内切酶进行 DNA 指纹识别DNA 指纹识别或分析的概念在上世纪 80 年代开始出现，是指根据来自于基因组的不同大小DNA 片段构成的独特图谱，对不同个体进行基因识别。换而言之，DNA 片段及其长度差异可作为区分标记物即所谓的“指纹”来进行基因识别（如等位基因），而不单纯依赖表型特征进行识别。如今，DNA 指纹识别技术的应用已经极为常见。大多数公众已经认识到 DNA 指纹识别和谱图在法医学和刑事案件之中的重要性，但该技术还在疾病检测和植物育种等其它领域也得到广泛使用。DNA 指纹识别技术的广泛应用促使业内开发了许多 DNA 指纹识别方法，而如何选择这些方法主要依赖实验目标及所研究的生物体。限制性片段长度多态性 (RFLP)限制性片段长度多态性简称 RFLP (英文发音为“rif-lip”，最原始的指纹识别方法即基于此概念。此方法的典型实验流程包括限制性酶切、片段分离、Southern 印迹杂交、探针杂交以及成像分析（图 1）。图 1.鉴定限制性片段长度多态性(RFLPs)的基本实验流程。第一步，使用一种或多种限制性内切酶消化经纯化的基因组 DNA。通常根据酶区分基因差异的能力和酶成本来选择合适的限制性内切酶。然后使用琼脂糖凝胶电泳分离酶切的片段。由于酶切产生的不同大小片段在凝胶上广泛扩散，会在凝胶上形成连续拖尾。为了检测所需的片段，将经凝胶分离的 DNA 片段转印到硝化纤维膜或 PVDF 膜上进行处理和检测。将一个带有标记的单链 DNA 探针杂交到膜上，以识别所需片段。将最终的结果成像，获得独特的 RFLP 指纹。RLFP 的探针基于基因组内的单拷贝数或低拷贝数序列，大小通常为 500 至 2,000 bp。将探针进行标记，检测超低量的样本，并识别将用作指纹基础材料的片段。观测到的 RFLP 标记物为特异性探针和限制性内切酶结合的结果。例如，探针 A 和 EcoRI 酶切的 DNA 可确定某个基因组的一种 RFLP。探针 A 和 HindIII 酶切的 DNA 会确定该基因组的另一种 RFLP（图 2A）。事先了解模板序列（虽然非必需），可以快速开发出有用的 RFLP 探针。RFLP 和限制性内切酶还可用于检测两个不同个体的 DNA 差异。图 2B简单阐释了探针杂交和检测，比较了两个个体的两个等位基因的 HindIII 酶切 RFLP（标为“1”和“2”）。在本例中，根据等位基因 2 HindIII 限制性位点的缺失或获得，探针 A 可以识别两个个体的不同限制性指纹。但在多数情况下，两个个体的片段长度差异是由于酶切位点外的 DNA 序列插入或缺失（由天然的重组或复制引起）所致。RFLP 分析还用于遗传咨询、动植物育种以及疾病监测等应用。Figure 2. Simplified RFLP fingerprinting. (A)Different RFLP markers are obtained from digestion of the same sample with two restriction enzymes separately, EcoRI and HindIII.(B)Two individuals (A and B) are distinguished by HindIII digestions of two alleles (1 and 2).尽管 RFLP 用处很大，但其仍存在部分局限。这种分析方法需要大量的起始样本 DNA，而且整个操作流程进展缓慢且繁琐。随着 PCR 技术的发展，许多此类缺点均已被解决例如， 可采用扩增片段长度多态性 (AFLP)技术，后者所需的样本更少，同时可采用更多基于快速 PCR 技术的实验方案执行。了解更多相关产品 Southern 印迹杂交 T-RFLP DNA 分离试剂盒 限制性内切酶 琼脂糖凝胶电泳 Southern 印迹杂交回到顶部扩增片段长度多态性 (AFLP)AFLP 是另一种基因作图技术，该技术不需事先了解基因组序列，即可通过 RFLP 及之后的选择性 PCR 从任意生物体的基因组 DNA 扩增片段。此外，AFLP 分析仅需少量起始模板（通常为 ng 级）。尽管 AFLP 最初专门针对植物研究而开发1，但如今其已在许多领域广泛使用，如： 绘制新物种的基因图谱 测定不同品种的相关性 建立交叉关联群 研究遗传多样性和分子亲缘关系AFLP 操作流程包括：酶切基因组 DNA 获得限制性切割片段，接头连接接头，PCR 扩增，电泳进行片段分离， 以及通过放射自显影或荧光法进行PCR 扩增子最终成像（图 3）。Figure 3. Illustration of the basic amplified fragment length polymorphism (AFLP) workflow.AFLP 的第一步，使用限制性内切酶（通常使用EcoRI 和 MseI）酶切基因组 DNA 样本。基因组 DNA 的 GC 含量会影响酶切效率和最终的指纹。例如，如果使用 MseI，当 GC 含量为65%） 可能妨碍 MseI 的酶切作用，导致片段量过低。同样，较低的GC 含量可有助 EcoRI 完全酶切。酶切完成后，会有两个接头连接在片段两端。这些接头经设计包括 1922 bp 序列以便后续引物结合，而接头的链接会破坏原来的 MseI 和 EcoRI 识别位点（图 3B）。接下来进行两轮 PCR 扩增：选择性预扩增以及之后进行的更具选择性扩增反应。在选择性预扩增 PCR 阶段，首先扩增连接有 EcoRI 和 MseI 接头的 DNA 片段（图 3C）。完成此步骤后，使用 3 端最多带三个额外碱基的引物对进行更具选择性的 PCR 反应（图 3D）。这类引物包括选择性核苷酸，其和严格的 PCR 条件一起作用可有助于确保仅与选择性引物3 端具有序列同源性的 DNA 片段才能被扩增。在这一选择性扩增步骤中，EcoRI 接头引物进行放射性标记或荧光标记以便进行下游片段检测，而 Msel 引物则不会被标记。选择性引物和选择性标记的组合可以精简后续的图谱，通过凝胶或电泳揭示独特的指纹（图 3E）。扩增后的指纹最佳组成范围为 50 至 200 个片段，片段长度范围为 45 至 500 核苷酸。在各种成像方法中，首选荧光标记结合毛细管凝胶电泳的方法，这是因为该方法可实现从片段分离到数据收集的自动化流程，有助于提高效率和稳定性。了解更多相关产品 AFLP 分析 Sanger 测序 毛细管电泳分析 DNA 分离试剂盒 限制性内切酶 定制DNA寡核苷酸 PCR 酶回到顶部限制性内切酶进行甲基化分析甲基化是一种在真核和原核生物基因组内都会存在的内源性 DNA 修饰和调控方式。尽管 DNA 甲基化也属于原核生物限制性修饰系统的一部分（参见限制性内切酶基础知识），但其在调控真核生物基因表达方面却发挥着更重要的作用2。目前人们已发现 DNA 甲基化参与调控许多细胞进程及疾病状态，如胚胎发育、X 染色体基因沉默、细胞周期调控和肿瘤形成。在许多植物和动物体内，甲基化通常发生在 5-CpG-3，表现形式为甲基基团添加到胞嘧啶的含氮环的第五个碳上，形成 5-甲基胞嘧啶3。在植物体内，5-CpNpG-3 和 5-CpNpN-3 处也会发生胞嘧啶甲基化，其中的 N 代表除鸟嘌呤之外的任意核苷酸。甲基化分析中的另一种重要成分是 CpG 岛。 CpG 岛是一个长度 5002,000 bp，富含 GC 的DNA 区域，通常见于基因的启动子和第一个外显子。由于 CpG 岛的甲基化状态可能会影响基因转录的失活和激活，因而成为了频繁研究的对象。在诸多研究 DNA 甲基化状态的方法中，限制性内切酶因其可用性和易用性而成为了热门工具。部分限制性内切酶的识别位点含有 CpG 序列，而这些酶对甲基化底物可能表现出不同的敏感度（例如，不受影响，被损坏、阻断或存在依赖性；另请参见限制性内切酶关键注意事项）。研究人员充分利用这一性质，广泛使用限制性内切酶作为位点特异性甲基化分析的基本工具。一些较为知名的方法包括： 结合重亚硫酸盐限制性内切酶分析(COBRA)，限制性酶切后进行qPCR （又称实时荧光定量 PCR 法 DNA 甲基化分析，简称 qAMP）。结合重亚硫酸盐限制性内切酶分析(COBRA)COBRA 是最热门的位点特异性 CpG 甲基化分析方法之一。其实验流程包括： 通过重亚硫酸盐处理实现胞嘧啶的化学转化，PCR 扩增经重亚硫酸盐处理的 DNA， PCR 产物的酶切消化，最后查看限制性酶切图谱，检验目标位点的胞嘧啶甲基化4,5。图 4阐释了 COBRA 检测的步骤。重亚硫酸盐处理 DNA 样本会将未甲基化的胞嘧啶转化成尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶（5-甲基化胞嘧啶）则不受影响。在之后的 PCR 过程中，引物在指定的位点扩增 CpG 岛。经 PCR 形成新链过程中，尿嘧啶作为胸腺嘧啶复制，而5-甲基化胞嘧啶则作为胞嘧啶复制。随后使用可识别扩增区域内CpG位点的限制性内切酶消化PCR 产物。如果原位点序列未甲基化，由于 PCR 扩增后酶切位点的胞嘧啶已被胸腺嘧啶取代，则不会发生酶切。如果原始序列上的酶切位点含有 5-甲基化胞嘧啶，则由于 PCR 后未修饰识别位点，限制性内切酶会在此处酶切 DNA。通过 PCR 产物的酶切图谱，可以判定原始位点序列的甲基化状态。Figure 4. Illustration of the combined bisulfite restriction analysis (COBRA) workflow with a 5-CGCG-3 locus sequence and a restriction enzyme (Bsh1236I) that recognizes a CG-containing sequence.进行 COBRA 分析各个步骤时，需要考虑若干注意事项。重亚硫酸盐处理时，由于任何残留的未甲基化胞嘧啶都会造成假阳性结果，所以胞嘧啶的转化效率尤为关键。但重亚硫酸盐对 DNA 作用剧烈，为避免 DNA 损伤，处理时间不可超过所需时长。请遵照试剂盒制造商建议的重亚硫酸盐转化处理时长，或在处理后根据经验判定转化效率。重亚硫酸盐处理后，由于 DNA 序列在未甲基化的胞嘧啶位置含有尿嘧啶，在 PCR 过程中，DNA 聚合酶必须能够读取含尿嘧啶的 DNA 模板（例如，TaqDNA 聚合酶）。最后，在酶切步骤，选择的限制性内切酶必须能够有效酶切 PCR 产物，以便获得可靠的甲基化分析酶切图谱。妥善解决这些问题后，COBRA 即可成为出色的甲基化分析方法。了解更多相关产品 表观遗传学研究 DNA甲基化分析 DNA甲基化学习中心 PCR学习中心 甲基化分析试剂盒 PCR 酶&预混液 限制性内切酶 琼脂糖凝胶电泳 DNA 纯化回到顶部使用限制性内切酶和实时荧光定量 PCR 进行 DNA 甲基化定量分析另一分析位点特异性 DNA 甲基化的常用方法是：直接酶切 DNA 模板，然后进行实时 PCR 或定量 PCR (qPCR)。此方法需要使用一组具有不同甲基化敏感度的同裂酶或异裂酶，从而检测特定位点的胞嘧啶甲基化状态。由于避开了重亚硫酸盐转化 DNA（参见 COBRA 分析）步骤，这一方法所需的起始 DNA 量更少，避免了重亚硫酸盐处理可能带来的 DNA 损伤，简化了实验流程。此外，与 COBRA 分析相比，此方法的 qPCR 还可对样本的甲基化状态进行定量检测6,7。选择不同甲基化敏感度的同裂酶或异裂酶的依据标准包括：目标位点（例如，CpG 岛或基因 体）以及可选的限制性内切酶。CpG 甲基化研究常用的一对内切酶是 MspI 和 HpaII，二者具有相同的识别位点 5-CCGG-3。靶标位点的胞嘧啶甲基化会完全阻断 HpaII 酶切，而 MspI 活性则不受影响。此外，为研究基因体（指基因被转录的序列）或低 GC 含量基因组区域的甲基化，您可改选其它同裂酶，如含有相同识别序列 5-TCGA-3 的 HpyF30I 和 TaqI。如果序列中的胞嘧啶被甲基化，HpyF30I 的酶切被阻断，而 TaqI 则不受影响。为了更彻底地鉴定位点特异性甲基化，除了对甲基化敏感的同裂酶/异裂酶外，还可使用只会酶切含甲基化胞嘧啶序列的限制性内切酶（图 5A）。经限制性酶切后，可以直接将 DNA 样本进行凝胶电泳，定量分析甲基化。请注意，酶切的 DNA 可能出现拖尾或多个较小的条带。使用凝胶电泳法时，根据此检测方法的灵敏度，可能需要加入更多量的 DNA 才能观察到片段（图 5B）。Figure 5. Methylation analysis by restriction digestion followed by gel electrophoresis and qPCR.进行甲基化定量分析时，酶切的 DNA 样本要进行 qPCR。PCR 引物经设计位于目标位点侧翼，从而使未酶切的底物继续作为 PCR 模板。剩余的未酶切 DNA 的水平取决于所用限制性内切酶的甲基化敏感度，如图 5A所示。DNA 的完整性水平越高，可供PCR 扩增的 DNA 模板就越多，在实时荧光定量 PCR 中就越早检测到 DNA 扩增（即，Ct值越低）。根据这一原理，依据 PCR 分析即可测定位点的甲基化状态（图 5C）。了解更多相关产品 表观遗传学研究 DNA甲基化分析 DNA甲基化学习中心 实时荧光定量 PCR (qPCR) 甲基化分析试剂盒 限制性内切酶 实时荧光定量 PCR 预混液 琼脂糖凝胶电泳 DNA 纯化回到顶部参考文献1. Vos P et al.(1995) AFLP: a new technique for DNA fingerprinting.Nucleic Acids Res23(21):4407-4414.2. Costello JF, Plass C (2001) Methylation matters.J Med Genet38(5):285303.3. Adams RL (1995) Eukaryotic D