【猪γ干扰素的表达及抗病毒活性研究】干扰素抗病毒活性特点有

【猪干扰素的表达及抗病毒活性研究】干扰素抗病毒活性特点有 摘要：利用技术从有丝分裂原刀豆素（）诱导的长白猪外周血淋巴细胞总中扩增出猪干扰素的成熟肽基因（），并将其亚克隆到原核表达载体中，构建重组表达载体。经、酶切及测序鉴定后，转化到大肠杆菌（）进行诱导表达，经和检测，表明猪干扰素获得了高效表达，并具有免疫活性，表达产物约为 ，主要以包涵体形式存在，产物经纯化、复性得到具有生物学活性的蛋白。利用细胞病变抑制法对其在系统上进行抗病毒活性测定，结果表明其抗活性为 。为进一步研究猪干扰素功能奠定了基础和理论依据。 关键词：猪干扰素；克隆；原核表达 ：；：0439114（11）112283-04 ， ， ， ， ， ， ， ， ， （ H V， ， ， ； K ， ， ， ） ： ， （） was ， ， ， （） ，was existed mainly in inclusion body （） ： （）； ； 年和从流感病毒感染的鸡胚细胞培养液中分离到一种生物活性物质，因其可干扰同源和异源病毒复制，故命名为干扰素（，）。现研究表明，干扰素是人或动物细胞受到病毒感染等刺激后，由淋巴细胞、巨噬细胞及体细胞等产生的一类细胞因子，不仅具有广谱抗病毒作用，还具有抗肿瘤和免疫调节等功能，。根据抗原性及分子结构差异，可将其分为类：型干扰素，包括、和等，主要起抗病毒作用；型干扰素，即；新发现的型干扰素。 我国是养猪大国，猪病毒性传染病种类多、危害大，虽然目前我国普遍接种猪病疫苗，但仍然不能很好的控制疫病。基因工程重组猪干扰素具有无副作用、无药物残留等优点，为新型兽药制剂。自年以来高致病性蓝耳病在我国暴发，给养猪业带来了巨大损失，大量临床研究也表明，干扰素为有效治疗该病的首选药物之一。又称免疫干扰素，主要由活化的细胞和细胞产生，具有抗病毒、抗肿瘤和免疫调节等功能，。重组对猪口蹄疫、猪繁殖与呼吸综合征以及猪水泡性口炎等病毒具有较好的抗病毒作用，同时由于其免疫调节特性，可以增强疫苗的免疫效果，具有良好的应用前景。 该研究利用原核表达系统，在大肠杆菌中成功高效表达猪，并初步研究了其对高致病性蓝耳病病毒（）的抗病毒活性，为进一步研究猪的抗病毒作用以及免疫调节作用提供了依据和基础。 材料与方法 质粒、菌株和毒株 原核表达载体及宿主菌、（）均由动物胚胎工程及分子育种湖北省重点实验室保存，高致病性蓝耳病病毒湖北分离株（株）由该实验室分离和保存。 试剂 猪淋巴细胞分离液购自天津灏洋生物制品有限公司； 购自和北京全式金公司；试剂盒、 聚合酶购自日本东洋纺公司；提取试剂盒、限制性内切酶、 连接酶购自公司；琼脂糖凝胶回收试剂盒购自上海生工生物工程有限公司；鼠抗猪单抗购自公司；标记的兔抗鼠购自公司。引物依据上公布的基因序列而设计，由上海生工生物工程有限公司合成。（扩增成熟肽基因上游引物）：（）；（扩增成熟肽基因下游引物）：（ ）。 本文为全文原貌 未安装PDF浏览器用户请先下载安装 原版全文 淋巴细胞的分离、诱导及总的提取 前腔静脉采集长白猪新鲜抗凝血 ，与液混匀后，小心加于 的淋巴细胞分离液的液面上，以 离心 ，小心吸取淋巴细胞层，用倍体积的 洗涤次，每次洗涤后 离心 。用含胎牛血清的 培养液稀释重悬至个，加入孔板中，于 培养箱中 培养 ，换液并加入终浓度为 的，继续培养 。收集淋巴细胞，按试剂盒说明书提取总。 猪干扰素基因的扩增 按照逆转录试剂盒操作说明对淋巴细胞总进行反转录操作，利用高保真度的 聚合酶和引物扩增猪干扰素的成熟肽基因（）片段，反应条件为 ， ， ， ，个循环后， 。 重组表达质粒的构建 将产物用凝胶回收试剂盒回收，用和 分别对基因扩增片段和载体质粒进行双酶切、回收、连接构建重组质粒，命名为。将连接产物转化感受态细胞，筛选阳性克隆，提取质粒，进行、酶切鉴定和序列测定（由上海生工生物工程有限公司完成）。 重组质粒的原核表达与检测 将重组质粒和表达载体分别转化大肠杆菌（），挑取转化子于含有卡那霉素（终浓度为 ）的培养基中， 、 摇床培养至对数生长期（）时，加入（终浓度为 ）诱导表达后，收集菌体，缓冲液重悬，进行超声波破碎，离心取上清和沉淀，按文献所述的方法进行检测和分析，所用的一抗为鼠抗猪单抗，二抗为标记的兔抗鼠。 重组猪干扰素（）的纯化与复性 将包涵体沉淀以含 mol/L尿素的缓冲液变性溶解， 离心 后，收集上清，按说明书进行镍柱纯化，洗脱液中加入适量复性液，装入透析袋，于 进行透析复性，期间更换透析缓冲液数次。复性后，采用法进行蛋白浓度测定，经 的滤膜过滤除菌后于保存。 重组猪干扰素的抗病毒活性测定 采用细胞病变抑制法测定重组在细胞上抗的活性。孔细胞培养板培养细胞至单层后，加入 倍倍比稀释的重组，每一稀释度设个重复， 培养 后，弃上清，加入 的，设只用重组处理不接毒对照组、正常细胞对照组和只接毒阳性对照组。接毒 后观察细胞病变（）情况。采用法计算重组蛋白的活性单位。 结果 基因的扩增 以诱导的长白猪外周血淋巴细胞的总为模板，利用方法扩增出猪干扰素的成熟肽基因（即去信号肽基因），琼脂糖凝胶电泳结果表明扩增片段大小约为 （图），符合预期。 重组质粒的酶切、测序鉴定 将构建的重组质粒用和 分别进行单、双酶切鉴定，结果见图。由图可见，用单酶切可得到一条约 的带，用 双酶切则出现约 的载体片段和约 的外源片段（）两条带。将重组质粒送至上海生工生物工程有限公司进行序列测定，测序结果进一步证明的成功扩增，且重组表达质粒构建正确，未出现读码框“移码”和终止突变等现象。 重组质粒表达与检测 的结果表明（图），含重组质粒的 诱导后在约处具有明显的表达带，大小与预期相符，而空载体转化的对照菌株在此处未见此条带。分析表明（图），表达的重组猪干扰素（）能够与抗猪的单抗发生特异性的免疫反应，说明所克隆的基因成功获得了表达，并具有良好的免疫反应活性。 重组猪干扰素的抗活性测定 表达的重组包涵体蛋白经过柱纯化和复性后，测得蛋白浓度为 。采用法计算重组蛋白的抗活性单位，能抑制 细胞发生的干扰素稀释度的对数距离比例+高于50%抑制病变比例的干扰素最高稀释度的对数=（81.8%-50.0%）/（81.8%-30.0%）+（-7）=-6.4，即将重组稀释至接 即可抑制的细胞发生（表），稀释度即为重组的效价，可计算出 ，即表达的重组猪干扰素抗效价为 ，即 。 讨论 为型干扰素，与型干扰素一样，也具有抗病毒作用，但抗病毒性能不及型干扰素。由于具有较强的免疫调节功能，主要表现在：（）可诱导类分子和类分子的表达，从而提高抗原提呈能力；（）参与辅助性细胞的调节；（）提高单核巨噬细胞和嗜中性白细胞的吞噬能力。所以，在机体对病毒感染的长期抵御过程中起着非常重要的作用，也是机体细胞免疫的重要检测指标之一，在疾病的诊断、预防和治疗方面具有极大的应用前景。 基因在正常情况下处于关闭状态，当机体受到某些因素的刺激后方可表达，而且表达量低，故提取和纯化天然的难度大、成本高。基因工程方法已成为生产的主要手段，高产、低成本、低副作用等特点，使得重组在临床上广泛应用。然而，相对人用干扰素，猪的研究却滞后许多。 基因含有个内含子和个外显子，所以我们用诱导猪外周血淋巴细胞，提取其总，进而通过扩增出来。由于采用大肠杆菌表达系统，而外源蛋白的信号肽段会使表达的蛋白锚定在细胞膜上，从而严重影响表达量，所以扩增时我们去除了端个氨基酸的信号肽序列，成功高效地表达了猪的成熟肽基因。 此研究利用表达载体表达的重组主要以包涵体形式存在，利用 mol/L尿素对其进行变性溶解，由于重组蛋白携带有载体的标签，故可采用镍柱进行纯化。纯化后的蛋白进一步采取透析复性方法进行蛋白的重折叠，使其恢复天然构象。通过对的抗病毒活性检测表明，复性的重组具有较好的生物活性。 总之，该研究利用大肠杆菌表达系统成功表达，并进行了提纯和复性，为进一步研究猪的抗病毒、免疫增强和免疫佐剂功能奠定了基础，并且为进一步临床应用研究提供了前提。 _： ， ，（）： ， ，（）： ， ， ，（）： ， ， ，（）： 陈雪梅，薛清华，祝荣格，等猪