膜片钳技术及应用ppt课件

膜片钳技术,细胞生物学樊国达学号：2014年12月23日,1,膜片钳技术,向细胞内注射恒定或变化的电流刺激，纪录由此引起的膜电位的变化，这叫做电流钳技术。在具体实验中，可通过给予细胞一系列电流脉冲刺激，诱发细胞产生动作电位。,2,电压钳技术是通过向细胞内注射一定的电流，抵消离子通道开放时所产生的离子流，从而将细胞膜电位固定在某一数值。由于注射电流的大小与离子流的大小相等、方向相反。因此它可以反映离子流的大小和方向。,3,膜片钳技术,膜片钳技术与电流钳、电压钳技术在命名上并不完全一致，后两者是从电学概念的角度命名的，而“膜片钳”主要是从机械物理学的角度命名的。,4,膜片钳技术,从字面上理解，膜片钳技术钳制的是“膜片”，是指采用尖端经处理的微电极与细胞膜发生紧密接触，使尖端下的这片细胞膜在电学上与其他细胞膜分离，这大大降低了背景噪声，使单通道微弱的电流得以分辨出来。,5,膜片钳技术,所以，膜片钳技术是一种通过微电极与细胞膜之间形成紧密接触的方法，采用电压钳或电流钳技术对生物膜上的离子通道的电活动进行记录的微电极技术。膜片钳技术是一种特殊的电压钳/电流钳技术。,6,膜片钳技术,用特制的玻璃微吸管吸附于细胞表面，使之形成10100G的密封，被孤立的小膜片面积为m2量级，内中仅有少数离子通道。然后对该膜片实行电压钳位，可测量单个离子通道开放产生的pA量级的电流，这种通道开放是一种随机过程。通过观测单个通道开放和关闭的电流变化，可直接得到各种离子通道开放的电流幅值分布，并分析膜电位与离子浓度等之间的关系。,7,膜片钳实验系统虽然可因研究目的不同而有所区别，但其基本组成是相同的，包括膜片钳放大器和接口，显微镜和视频监视器以及防震台和屏蔽罩等。,8,倒置显微镜、防震台、屏蔽罩、三维操纵仪,三维操纵仪,倒置显微镜,9,膜片钳放大器,10,膜片钳实验流程,膜片钳实验方法包括：制备玻璃微电极；制备细胞标本；建立高阻封接；电流记录。,11,制备玻璃微电极,拉制微电极材料：硼硅酸盐毛细玻璃管。要求：玻璃毛胚外径1.31.7，内径1.01.2，壁的厚度在0.2以上。管壁越厚，拉制出的电极尖端管壁也越厚，电极的跨壁电容就越小，噪声也就越低。,12,玻璃微电极及膜片的几何形状,13,电极拉制仪,14,拉制方法：两步拉制法。第一步：使玻璃软化，并拉开一个距离，形成一个细管，即拉制电极的颈部；第二步：使用较低的热度，拉断细管部，成为两个基本相同的玻璃微电极，此步控制电极的尖端。一般拉制出的玻璃微电极尖端直径为15m。,15,涂胶和抛光,对玻璃微电极进行涂胶和抛光。涂胶（疏水性涂料，如硅酮树脂）主要是为了减小电极的跨壁电容。,16,抛光仪,抛光是指将玻璃微电极靠近加热的铂丝，从而使电极尖端变光滑的过程。抛光主要目的是。防止电极尖端刺破细胞，利于高阻封接。,17,电极液的充灌,对于尖端较细的玻璃微电极，膜片钳实验中常用的方法是：在微电极尾部施加负压使尖端充灌电极内液，然后用注射器在微电极尾部充灌电极内液，最后轻弹微电极杆步使其内的气泡排出。充灌长度为电极的1/3。,18,制备细胞标本,从理论上来讲，膜片钳实验用的细胞标本可来自体内各种组织细胞，只要细胞表面光滑，能与微电极尖端形成高阻封接即可。但在标本制备上，不同组织细胞间联接牢固程度不同，采用的分离方法也不完全相同。大体上包括冲洗、酶解消化或机械分离以及清洗等步骤。,19,建立高阻封接,在显微镜下找到微电极，移动三维操纵仪，使电极尖端接触细胞，形成高阻封接。,20,建立高阻封接,高阻封接形成是进行膜片钳实验的关键一步。微电极尖端与细胞膜形成封接的过程，可以采用软件发出1mV脉冲电压作用于微电极，造成膜两侧电位差发生变化，产生电极电流，再通过显示屏，观察电极电流幅度的变化来确定封接程度。在电极未入溶液之前，在显示器上可见一直线。,21,高阻封接形成的电流图,22,膜片钳技术四种基本记录模式,细胞吸附膜片(cell-attachedpatch)将两次拉制后经加热抛光的微管电极置于清洁的细胞膜表面上，形成高阻封接，在细胞膜表面隔离出一小片膜，既而通过微管电极对膜片进行电压钳制，高分辨测量膜电流，称为细胞贴附膜片。由于不破坏细胞的完整性，,23,全细胞记录法(Whole-cellrecording)在高阻抗封接做好后，再给一个很小的负压，将电极覆盖的膜吸破，使电极内与整个细胞内相通，用这个方法可记录进出整个细胞的电流。,24,内面向外膜片(inside-outpatch)高阻封接形成后，在将微管电极轻轻提起，使其与细胞分离，电极端形成密封小泡，在空气中短暂暴露几秒钟后，小泡破裂再回到溶液中就得到“内面向外”膜片。,25,外面向外膜片（Outside-outpatch）在全胞记录式的基础上，拉开电极使之与胞体脱离，这是附在电极尖端的膜片又可自动地将电极尖端口封住。此膜片的外侧面向外其是在全细胞记录的基础上改进而成。,26,膜片钳技术的应用,2008年，第二军医大学基础部生物物理研究所的研究人员采用膜片钳和激光扫描共聚焦显微镜，同步实时系统观察心肌细胞钙离子的释放。,27,基本原理,膜片钳能获得膜上钙离子通道的离子电流，但不能对离子的移动进行实时定位，不能定量分析离子浓度。激光扫描共聚焦显微镜可以对钙离子的移动进行实时定位,但无法对单个离子通道的离子移动信号(如单通道电流)进行分析。,28,大鼠心室肌细胞L2型钙通道电流(ICa,L