分子生物技术在食品检测中的应用实例ppt课件

分子生物技术在食品检测中的应用,PCR,聚合酶链式反应（polymerasechainreaction,PCR）是一种在体外特异地扩增已知基因的方法；由K.Mullis于1983年建立；可用于分析基因及其产物的水平变化；可进行实时、定量分析；,PCR,4,工作原理,53,35,+,+,5,5,变性、退火,引物,53,35,+,5,5,dNTPs,TaqDNA聚合酶,不同长度新链DNA,循环1,+,引物,变性、退火,PCR,2530次循环后，模板DNA得到扩增,53,35,+,53,35,+,+,dNTPTaqDNA聚合酶,均一长度新链DNA,循环2,PCR,模板引物dNTPMg2+TaqDNA聚合酶,变性,延伸,退火,PCR,用途一：目的基因的克隆,利用特异性引物以cDNA或基因组DNA为模板获得已知目的基因片段,或与逆转录反应相结合，直接以组织和细胞的mRNA为模板获得目的片段；利用简并引物从cDNA文库或基因组文库中获得序列相似的基因片段；利用随机引物从cDNA文库或基因组文库中克隆基因。,PCR,用途二：DNA和RNA的微量检测,PCR技术高度敏感，对模板DNA的量要求很低，是DNA和RNA微量检测的最好方法。,PCR,PCR,PCR,延伸一、荧光定量PCR,在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。,SYBRgreenI水解探针TaqMan分子信标,PCR,SYBRgreenI,未结合的SYBRgreenI,PCR,水解探针TaqMan,PCR,PCR,分子信标,PCR,PCR,延伸二、多重PCR,多重PCR示意图A：普通PCR；B：多重PCR,PCR,延伸三、RT-PCR,反转录PCR（reversetranscriptionPCR，RT-PCR）是将RNA的反转录反应和PCR反应联合应用的一种技术。RT-PCR是目前从组织或细胞中获得目的基因以及对已知序列的RNA进行定性及半定量分析的最有效方法。,PCR,延伸四、PCR-ASO,等位基因特异性寡核苷酸(allelespecificoligonucleotide）是基于核酸杂交的一种方法。根据已知基因突变位点的碱基序列，设计和制备野生型或突变型基因序列互补的两种探针，分别与被检测者样品中的DNA分子进行杂交，根据样品与两种探针杂交信号的强弱，确定是否存在基因突变，判断被检者是突变基因的纯合子或杂合体。,PCR,N：正常基因；H：杂合子基因；M：突变基因,ASO1,ASO2,N,H,M,PCR,利用错配碱基引物的ASO-PCR检测小麦赤霉病菌对多菌灵抗菌株Codon200TTCTAC基因型植物病理学报2011,Vol.41Issue(3):278-284DOI:,寡核苷酸探针法(PCR-ASO)检测家蝇拟除虫菊酯kdr抗性相关的L1014F点突变曹晓梅；赵彤言；董言德寄生蟲與醫學昆蟲學報；13卷4期(2006/12/01)，P217-220,PCR,延伸五、PCR-SSCP,单链构象多态性分析（single-strandconformationpolymorphism）DNA的突变造成DNA片段中碱基序列不同，变性为单链后在中性聚丙烯酰胺凝胶中的构象不同（单链构象多态性），利用迁移率的差别可使各种序列不同的单链分离开来。,PCR,PCR-SSCP分析原理示意,PCR,正常人,纯合突变,杂合突变,+,PCR,延伸六、PCR-RFLP,限制性片段长度多态性分析（restrictionfragmentlengthpolymorphism）由于DNA变异产生新的酶切位点或原有的酶切位点消失，在用限制性核酸内切酶消化时产生不同长度或不同数量的片段。设计适当的扩增引物，使扩增片段包括某一个或数个限制性内切酶识别序列，在PCR扩增后用该限制酶切割PCR产物，根据电泳后酶切片段长度变化，即可作出诊断。,PCR,GAATTC,CTTAAG,EcoR限制性内切酶位点的变化,PCR,1985年，英国遗传学家Jeffeys等人用TR的核心序列为探针进行RFLP分析时，检测到许多HVR，并产生相应的图谱，所得图谱具有高度的个体特异性，达到了如同人类指纹那样的高度专一性，所以称其为DNA指纹图谱（DNAfingerprinting）,AlecJohnJeffreysOxford,UnitedKingdom,PCR,亲权鉴定与DNA指纹图由此图可推断出：A和C是亲生女儿；B为妻子和其前夫所生；D为养女。,PCR,DNA指纹用于罪犯识别,LAMP,PCR电泳图,LAMP电泳图,PCR反应条件,LAMP反应条件,PCR反应试剂,LAMP反应试剂,反应液（-20保存）,LAMP,LAMP,核酸适配体,核酸适配体（Aptamer）是一段DNA（脱氧核糖核酸）或者RNA（核糖核酸）序列。具有类似抗体识别功能的核酸分子，比传统抗体更稳定，保存时间长，可以进行多种修饰。,核酸适配体,实例一：当核酸适配体与目标物质发生特异性结合时，核酸适配体自身的构型会随之发生变化。研究者把核酸适配体应用于探针，开发了很多基于核酸适配体的构型变化的电化学传感器，又称为E-AB（Electrochemicalaptamer-based）传感器，与电化学检测方法的结合使之具备便携化、操作简单、成本低等特点，所以E-AB传感器提高了核酸适配体在传感器领域的应用,核酸适配体,一种适配体传感器抗生素残留快速检测仪申请号：201310576568申请日：2013年11月19日,本发明涉及一种适配体传感器抗生素残留快速检测仪，由适配体传感器，信号检测与处理系统，显示与打印存储系统，供电系统组成。用壳聚糖、戊二醛与铁氰化钾复合物修饰的工作电极，再用纳米金胶将适配体固定到电极表面，制备适配体传感器。检测适配体传感器接触抗生素前后电流的变化来测定抗生素的浓度。信号处理电路将采集的微弱电流信号进行I/V转换，放大，滤波，A/D转换最终将数字量信号送入微控制器进行程序处理；该检测仪可对检测样品中的抗生素残留量是否超标及浓度值进行显示、存储和打印。本发明的适配体传感器抗生素残留快速检测仪可准确快速的检测样品中是否含有某种抗生素等信息，非常适合对抗生素残留进行现场快速检测的场合。,核酸适配体,核酸适配体,一种检测孔雀石绿的核酸适配体电化学生物传感器的制备方法及应用申请号：201410008020申请日：2014年1月8日,该电化学生物传感器利用电极表面修饰技术，将制备的石墨烯-壳聚糖复合物和纳米金修饰到电极表面，再通过化学作用将核酸适配体接在纳米金上，通过适配体与目标物的特异性结合作用将目标物结合到电极表面，然后在接上目标物的抗体，构成夹心结构的生物传感器。当检测的溶液中含有目标物时，就能在电极表面固定一定量的目标物和相应的抗体，构成传感结构。由于抗体上修饰了辣根过氧化物酶（HRP），能催化过氧化氢的分解，从而产生电化学信号的变化，利用电化学信号的变化即可实现对孔雀石绿（MG）的检测。本发明制备的核酸适配体电化学生物传感器选择性强，灵敏度高，操作简单快速，适合水产品中孔雀石绿（MG）的检测。,核酸适配体,基于适配体放大技术检测microRNA河北大学【学位级别】：硕士,孔雀石绿适配体（MGA）是由38个核糖核苷酸构成的一段RNA序列。孔雀石绿（MG）是一种三苯甲烷类染料，由于不具备分子刚性结构而没有荧光。孔雀石绿能够与孔雀石绿适配体特异性结合形成三维空间结构，起到固定孔雀石绿平面结构的作用，从而使孔雀石绿产生强的荧光发射。本论文中我们建立了一种基于适配体放大技术方法来检测miR-143。首先根据目标miR-143序列设计扩增模板，该模板包括：目标miR-143互补序列，T7RNA聚合酶启动子序列和孔雀石绿适配体互补序列。当目标分析物miR-143存在时，miR-143与模板杂交，在聚合酶作用下延伸产生T7启动子，T7RNA聚合酶能够识别T7启动子，并以含有T7启动子的双链DNA为模板，合成RNA孔雀石绿适配体。孔雀石绿适配体与孔雀石绿结合后在650nm处发射荧光。该方法可以定量检测到50pmol/L的miR-143，具有4个数量级的动态范围。,核酸适配体,实例二：可视化检测方法,生物素-亲和素-HRP纳米金,核酸适配体,一种基于酪胺信号放大技术和适配体识别的金黄色葡萄球菌可视化检测方法申请号：201310473852申请日：2013年10月11日,本发明提供了一种基于酪胺信号放大技术和适配体识别的金黄色葡萄球菌可视化检测方法，本发明涉及到分子生物学和微生物学的方法及技术，属于生物技术领域。其方法主要是利用生物素标记的金黄色葡萄球菌的适配体能够特异性的识别和结合金黄色葡萄球菌，从而实现对菌体的捕获，通过亲和素与生物素的结合将菌体固定到包被链霉亲和素的酶标板的底部，然后再将生物素标记的适配体和Streptavidin-HRP的复合物固定到菌体表面。在H2O2的作用下，HRP催化沉积生物素-酪胺分子沉积在HRP周围的位点上，这时体系中再次加入Streptavidin-HRP，通过生物素与链霉亲和素的结合而导致HRP大量的结合在菌体上，从而使信号实现几何级的放大。本方法建立的方法能够对金黄色葡萄球菌实现快速、灵敏、准确的检测，对于食品安全有着重要的意义。,核酸适配体,一种基于纳米金标记的金黄色葡萄球菌可视化检测方法申请号：201310481326申请日：2013年10月15日,本发明涉及一种基于纳米金标记的金黄色葡萄球菌可视化检测方法，将与金黄色葡萄球菌的目标DNA互补配对的且经巯基修饰的DNA1和DNA2分别与1014纳米的纳米金连接制成DNA1-适配体探针和DNA2-适配体探针，用DNA提取试剂盒提取待测物中的DNA,然后将DNA1-适配体探针和DNA2-适配体探针混匀后，加入待测物中的DNA，混匀，在9095热处理46分钟后，降温至37以下，在400900纳米进行UV-vis扫描，即可实现对待测物中的金黄色葡萄球菌的定量检测。与现有技术相比，该方法灵敏度高、操作简单、成本低。灵敏度25cfu/ml,核酸适配体,基于纳米金标记-适配体识别的伏马菌素B1检测新方法食品科学与技术国家重点实验室2012年,基于核酸适配体识别和纳米金变色效应构建了伏马菌素B1FB1的可视化检测新方法实验以纳米金为载体首先在纳米金表面组装巯基化的适配体互补短链DNA1/FB1-适配体复合物当加入目标物时适配体链与目标物结合与互补短链DNA1发生解离此时再加入纳米金标记的与适配体互补短链1互补的短链DNA2二者杂交可导致纳米金粒子的聚集而使溶液颜色发生变化进而实现目标物的可视化检测通过条件优化有效避免了由于盐浓度过高使纳米金发生聚集所产生的误差同时在纳米金与短链DNA孵化时加入表面活性剂十二烷基硫酸钠SDS使NaCl浓度达到了500mmol/L而纳米金颜色仍不发生改变打破了以往熟化NaCl浓度100mmol/L就使纳米金颜色发生变化的界限使附着在纳米金上的DNA量扩大了3倍方法检测线性范围为1251500ng/L检测限为125ng/L该方法已成功应用于啤酒中FB1的检测,核酸适配体,基于胶体金核酸适体体系筛查肝癌新方法的建立江苏省南通市疾病预防控制中心2013年,胶体金具有较大的比表面积能吸附形成耐一定浓度盐的胶体金体系胶体金能与肝癌的核酸适体组装成胶体金肝癌核酸适体体系由于肝癌核酸适体与肝癌细胞的特异的分子识别作用折叠形成特定的三维结构会使得吸附在胶体金表面的核酸适体和胶体金分离胶体金在没有大分子的保护下遇盐会被破坏而聚集变成蓝色。基于此原理建立了胶体金核酸适体体系筛查肝癌新方法,体外表达,1、从生物体中分离得到目的基因（或DNA片段）2、在体外，将目的基因插入能自我复制的载体中得到重组DNA分子。3、将重组DNA分子导入受体细胞中，并进行繁殖。4、选择得到含有重组DNA分子的细胞克隆，并进行大量繁殖，从而使得目的基因得到扩增。5、进一步对获得的目的基因进行研究和利用。比如，序列分析、表达载体构建、原核表达以及转基因研究和利用等。,体外表达,原核表达系统,真核表达系统,大肠杆菌,枯草芽胞杆菌,YEAST,CELLCULTURE,INSECTCELL,TRANSFERREDGENE,简单,便宜,大量,无修饰,复杂,昂贵,有修饰,体外表达系统,体外表达,体外表达,外源基因的高效表达,获得有重要价值的蛋白质产品,需将编码所需蛋白的基因插入质粒或其它载体,然后导入活细胞,基因工程的最终目的,酶受体抗原抗体生成,体外表达,酶,EasyTaqDNAPolymerase是从克隆