《分子杂交》PPT课件

核酸分子杂交NucleicAcidHybridization,1分子杂交概念及应用,分子杂交：在分子克隆中的一类核酸和蛋白质分析方法，用于检测混合样品中特定核酸分子或蛋白质分子是否存在，以及其相对分子质量的大小。,分子杂交实质上是DNA或RNA单链之间退火形成DNA/RNA或DNA/DNA杂合分子。应用范围：重组子鉴别基因分离DNA片段分析基因表达研究。,当用一个标记核酸分子与核酸样品杂交，便可以查明该样品中是否存在与该标记核酸分子具有同源性的分子。,2探针的概念及其标记技术,2.1探针(probe):用于检测特定基因或转录产物存在或表达的DNA、RNA或寡核苷酸。,2.2探针的标记技术2.2.1均匀标记2.2.2末端标记,2.2.1均匀标记,切口平移法标记,随机引物标记PCR扩增标记要求：a-32PdNTP,5,3,5,3,5,5,5,5,5,5,3,3,3,3,3,3,热变性,随机引物退火,-32PdNTPKlenow酶,5,5,5-,-5,2.2.2末端标记,DNA片段的末端标记Klenow酶3-末端补平(3-末端标记)5-ACGTTGCAAACTG-33-TGCAACGTTTGAC-5,四种不同的补平反应,5-GGATCC-3BamHI5-GGATCC-33-CCTAGG-53-CCTAGG-5dNTPdGTPdGTP/dATPdGTP/dATP/dTTP5-GGATC5-GG5-GGA5-GGAT3-CCTAG3-CCTAG3-CCTAG3-CCTAGGATCC-3GATCC-3GATCC-3GATCC-3CTAGG-5GG-5AGG-5TAGG-5IS1S1S15-GGCC-35-GGATCC-35-GGATATCC-33-CCGG-53-CCTAGG-53-CCTATAGG-5IIIII,T4DNApolymeraseT7DNApolymeraseT4多核苷酸激酶(T4polynucleotidekinase)末端脱氧核苷酸转移酶(TdT),合成寡核苷酸的标记T4多核苷酸激酶(T4polynucleotidekinase)末端脱氧核苷酸转移酶(TdT),3分子杂交技术,根据检测对象的不同：Southern杂交Northern杂交Western杂交斑点杂交狭线杂交菌落杂交,1975年,Southern印迹杂交（Southernblot）由英国人埃德温迈勒萨瑟恩（EdwinMellorSouthern）创建。,3.1Southern杂交,埃德温迈勒萨瑟恩,Southern杂交操作步骤：,印迹转移(blotting)将DNA片段从琼脂糖凝胶转移到滤膜的方式。,印迹转移方式(1)毛细管渗吸法,白瓷盘,玻璃板,滤纸,凝胶,尼龙膜,滤纸,吸水纸,玻璃板,重物,毛细管渗吸法,印迹转移方式(2)真空转膜,印迹转移方式(3)电转移,分子杂交预杂交目的：将滤膜的空白处用鱼精DNA或牛奶蛋白封闭起来，防止在杂交过程中滤膜本身对探针的吸附。预杂交液实际上就是不含探针的杂交液，其中主要含有鱼精DNA、牛血清等，这些大分子可以封闭膜上所有非特异性吸附位点。,杂交在一定的溶液和温度下，将标记的探针与滤膜混合；洗涤251SSC/0.1%SDS杂交温度0.25SSC/0.1%SDS放射性自显影或生化检测。,带有DNA片段的凝胶,Southern印迹杂交的技术流程,Southern杂交,EdwardSouthern（1）提取总DNA（2）酶解（3）电泳（4）转移到滤膜（5）变性解链（6）DNA探针及杂交（7）洗脱（8）放射自显影（9）比较分析,Southern杂交的主要应用：判断某一生物样品中是否存在某一基因，以及该基因所在的限制性酶切片段的大小。,3.2Northern杂交,印迹转移的是总RNA或mRNA。应用：在转录水平上某基因是否表达，在有合适对照的情况下，通过杂交信号的强弱可比较基因表达的强弱。,3.3Western杂交,印迹转移的是蛋白质。将待检测蛋白质（或酶）经PAGE电泳并染色后，转移到滤膜上固定，再用“抗体-抗原”免疫反应鉴别滤膜上的蛋白质。探针:针对某一蛋白质制备的特异性抗体。,以上分子杂交可以获得精确的结果，但操作繁杂。当样品量比较大时，难以满足试验需求。当样品量比较大时，可以采用简化的方式做初步的检测，然后再对阳性样品作精确的检测。,3.4菌落杂交,基本操作步骤：将细菌菌落影印到滤膜上；对滤膜上的菌体做原位裂解使DNA释放处来，并固定在滤膜上；分子杂交。用途：从质粒或黏粒载体构建的基因文库中寻找阳性克隆子，然后Southern杂交进一步筛选。,3.5噬菌斑杂交,基本操作步骤：将噬菌体基因组文库影印到滤膜上，使噬菌体中的DNA释放并固定在滤膜上。分子杂交用途：从噬菌体载体构建的基因文库中寻找阳性克隆子，通过Southern杂交进一步验证。,3.6斑点杂交,直接将DNA或RNA以斑点的形式固定在滤膜上，然后进行分子杂交。当核酸分子的斑点面积变得更小时，在单位面积滤膜上处理的样品的数量更