《型PCR荧光分析仪》PPT课件

1890型PCR荧光分析仪,介绍及应用,实时荧光定量PCR的应用,临床方面的应用疾病的临床早期诊断建立病原体病分子诊断标准疗效考评指导制订感染性疾病合理治疗方案了解感染性疾病病人用药后病情的变化情况医院、血站及防疫站的确诊新药研究中药物的作用效果研究Elisa方法的漏检率病毒性疾病中病毒的耐药性变异株的测定，为疾病治疗进行指导,遗传病诊断中的应用等位基因检测多基因遗传病的突变检测基因表达异常所致遗传病检测在肿瘤诊断中的应用肿瘤相关基因表达的检测肿瘤标志物（肽类激素和酶）肿瘤耐药基因（MDR）,何谓PCR?,聚合酶链反应(PolymeraseChainReaction)简称，是一项在短时间内大量扩增特定的片段的分子生物学技术。,试剂的定量原理：,Roche杂交探针定量分子信标定量SYBRGreen染料定量Taqman水解探针定量,PCR的发展史,这项技术的发明人是KaryMullis。年，在一家生物高技术公司（）工作的Mullis着手解决用简单的方法鉴定某一段的技术问题，有一天晚上他驱车在北部加州号高速公路上，灵机一动想到了一个实际上可以无限扩增某段的简单方法，即。在年的一次学术会议上，此方法首次被介绍，在分子生物科学家中也引起了强烈的反应。给了Mullis一万美元的奖金，随后把这项技术的专利以三亿美元的价格转让给另一家生物高技术公司。在短短的几年内，迅速成为分子生物学的一项常规手段，并得到了广泛的实际应用，被许多科学家视为近十年来分子生物学领域最重要的一项技术突破。年，Mullis因此获得诺贝尔化学奖。,PCR原理和方法:(一),众所周知，是由四种碱基按互补配对原则（即腺嘌呤对胸腺嘧啶，鸟嘌呤对胞嘧啶）组成的螺旋双链。在细胞内，复制时，解螺旋酶首先解开双链让它变成单链做为模板，然后，另一种酶-聚合酶合成一小段引物（）结合到模板上，最后，合成酶以这段引物为起点，合成与模板配对的新链。即是在体外模拟复制的过程，它用加热的办法让所研究的片段变性变成两条单链，人工合成两个引物让它们结合到模板的两端，聚合酶即可以大量复制该模板。假定我们要研究的双链两端的序列是：TATTCGGGCTTTCCAAGCAACTAG.GATCTATCCAACGGCTAGGCATTTATAAGCCCGAAAGGTTCGTTGATC.CTAGATAGGTTGCCGATCCGTAAA在之前，我们首先人工合成两段有碱基的引物，能够分别与上下两条链的一端配对，比如一条是（为与模板能够区别，以小写表示）:ataagcccgaaaggttcgtt，另一条就是tttacggatcggcaacctat。把这两段引物和模板、聚合酶、底物（四种脱氧核苷）混合在一起，我们就可以开始做了。,PCR原理和方法:(二),第一步叫“变性”，把样品加热到摄氏度一到数分钟，让模板变性变成单链。第二步叫“退火”，让样品的温度下降到摄氏度一到数分钟，引物就可以结合到模板上去。TATTCGGGCTTTCCAAGCAACTAG.GATCTATCCAACGGCTAGGCATTTataagcccgaaaggttcgtttatccaacggctaggcatttATAAGCCCGAAAGGTTCGTTGATC.CTAGATAGGTTGCCGATCCGTAAA第三步叫“延伸”，让样品的温度上升到摄氏度一到数分钟，聚合酶就可以从引物开始用底物复制出新链。TATTCGGGCTTTCCAAGCAACTAG.GATCTATCCAACGGCTAGGCATTTataagcccgaaaggttcgttGATC.CTAGATAGGTTGCCGATCCGTAAATATTCGGGCTTTCCAAGCAACTAG.GATCtatccaacggctaggcatttATAAGCCCGAAAGGTTCGTTGATC.CTAGATAGGTTGCCGATCCGTAAA这样经过三步一个循环，一条双链就变成了两条，再来一个循环，就变成了四条在一个由计算机控制的循环加热器上经过三十个循环，就可以把原来的样品精确地扩增了的次方倍，而这只需要两三个小时。,影响PCR特异性的因素,退火步骤的严格性：提高退火温度可以减少不匹配的杂交，从而提高特异性。减短退火时间及延伸时间可以减少错误引发及错误延伸。引物二聚体是最常见的副产品，降低引物及酶的浓度也可以减少错误引发，尤其是引物的二聚化。改变MgCl2(有时KCl)浓度可以改进特异性，这可能是提高反应严格性或者对Taq酶的直接作用。模板中如果存在次级结构，例如待扩增的片段易自行形成发夹结构时，可在PCR混合物中的4dNTPs中加入7-脱氮-2-脱氧鸟苷-5-三磷酸（7-deaza-2-deoxyguanosine-5-trihosphate）(de7GTP)。用de7GTP与dGTP比例为3：1的混合物（150mol/lde7GTP+50mol/LdGTP）代替200mol/ldGTP，则可阻非特异性产物的生成。,扩增反应可以无穷进行下去吗？,答：不可以。因为经过一定的循环周期后需扩增的片段不再按指数增多而逐渐进入平坡，进入平坡的循环次数，取决于起始时存在的模板拷贝数以及合成的DNA总量。所谓平坡就是批PCR循环的后期，合成产物达0.31pmol时，由于产物的堆积，使原来以指数增加的速率变成平坦的曲线。造成PCR进入平坡的原因有：引物和dNTP等消耗完毕Taq酶失活底物过剩非特异性扩增产物的竞争退火时产物的单链自己缔合变性在高浓度产物条件下，产物解链不完全，以及最终产物的阻化作用（焦磷酸化，双链DNA）。,总而言之，PCR的条件是随系统的而异的，并无统一的最佳条件，先选用通用的条件扩增，然后稍稍改变各参数，可以达到优化，以取得优良的特异性和产率。,实时荧光定量PCR的Ct值,由图我们也可以看出，在Ct值所在处重复性惊人的好。,Ct值的含义是：每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。由于所设阈值都很低，所以Ct值分析实际上就是低浓度的荧光值分析。由于是低浓度，影响因素小，误差没被放大，所以具有良好的重现性,Ct值，C代表Cycle，t代表threshold。,由图可以看到当扩增越靠后定量的重复性就越差。主要是因为荧光定量技术要求在低浓度坏境。因为荧光检测定量原理是在忽略分子间相互作用的情况下建立的。如果分子浓度高了，影响作用很复杂，而PCR扩增产物是高浓度的，因此重复性变差也很容易理解。由于扩增末期，扩增效率可能因为大量的靶序列而产生不可控的影响。,仪器的Ct值定量原理,固定循环数后，荧光信号与模板数成正比，但当固定荧光信号值后，模板数就与循环数成反比。每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。,横坐标代表起始拷贝数的对数,纵坐标代Ct值,利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线,1890型PCR荧光分析仪的特点,高速的加热降温循环系统采用长寿命的LED激发光源可对PCR扩增全过程进行实时动态监测无需开启PCR反应管，可避免在PCR期间及PCR之后产物污染，确保结果准确,可用三种不同报告染料同时用于一个样品，在单一反应中取得更多信息全中文界面，灵活的程序设定、全面的分析和报告功能，全部参数可储存可打印多个或单个样本报告,仪器主要技术规格,样本数：32反应管（光学玻璃管）长：35mm容积（反应体积）10-20ul温度范围：40-98温度控制：1/S-10/S激发光波长：470nm（LED）发射光波长：530，640，710nm检测灵敏度：可在一个基因组中检测单拷贝软件操作系统：Win2000输入电源/功率：AC220V50HZ/800VA,仪器工作原理（一）,仪器工作原理（二）,图一盖中的加热器在计算机控制下向热室中交替注入热气和环境空气，热室中温度由风扇电机搅匀，由于空气无有效质量，热室可以迅速达到设置温度，由此进行PCR的温度循环。32个样品在周向马达的带动下逐一经过信号采集的光学系统，为采样的准确定位光学结构由丝杆马达进行微调。由长寿命的LED光源（470nm）激发毛细管中的荧光，该荧光通过一组复合滤镜和透镜分别同时到3个接收器上（520nm,640nm,710nm）,完成了仪器的实时采样。,强大的软件功能,参数设置功能（包括温度、时间、循环数、升降温速率、检测通道选择）样本资料记录功能文件运行显示功能（PCR热循环数据显示、荧光检测数据显示）检测数据分析功能分析结果输出功能故障保护和报警功能,先进的光路系统,选用长寿命LED激发,无需预热，无需校正采用了先进的非球面镜设计，提升了仪器的光学性能，缩短了光程，使仪器更小巧优质的滤光片，硬膜镀膜技术，窄带低背景高透过率不霉变实时三色荧光检测，尽善尽美,传统96孔板和离心毛细管比较,毛细管96孔板标本量小，耗材成本稍高标本量大，耗材成本低由于离心，每个样品孔间温度由于加热模块的边缘效应，每个均匀一性好样品孔间温度存在差异加热介质空气与反应体系无缝96孔板反应面积大，故升降温接触，接触面积大，故升降速度慢温速度快一个40个循环的实验只需30-45一个40个循环的实验需要2小时分钟光源与检测器对每个样品来说每个样品孔距离光源和检测器是等距离的，减少了系统误光程不同，可能对结果产生差影响,由于定量PCR必须借助于样本和标准品之间的对比实现定量，旋转的样品架很好地解决了样品孔间的均一性，最大程度的保证了标准曲线与样品之间条件的一致性，避免了微小差别被指数级发大。,优异的灵敏度宽广的线性动力学范围,仪器能在7个数量级的范围内得到非常好的线性结果。相关系数（r）可达