鸡白介素的进展

.,技术研发工作汇报,综述鸡白介素2（IL-2）的研究进展,.,报告主要内容,.,第一部分白介素的概述,.,白细胞介素(Interleukin,IL)简称白介素,是由白细胞产生的、介导细胞间相互作用的细胞因子,在细胞的活化、增殖和分化中起调节作用,是20世纪80年代后才发现的一类细胞因子。IL与其他免疫系统,通过作用于T细胞、B细胞及自然杀伤细胞(NK)等多种靶细胞来传递免疫信息,激活、调控血细胞的生长发育与分化成熟,参与机体的免疫应答,参与某些疾病的病理过程。由于白介素具有广泛的生物学功能，且用量极小就可以起到重要的介导效应，因此，目前有多种经基因工程生产的白介素已经或将要用于临床。,.,1.1白介素的种类与生物学功能,天津生机集团股份有限公司,白介素是一类低相对分子质量的蛋白多肽，白介素家族的大多数成员在氨基酸序列、结构、理化特性和生物学功能等方面均不相同。,.,.,.,人的白介素研究在近十几年来发展很快,现在已广泛应用于疾病的治疗和疫苗的免疫增强剂,但动物的白介素研究相对滞后,鸡的白介素发展更加缓慢,但随着分子生物学等相关学科的发展,有关鸡白细胞基因与功能的研究已逐渐成为热点,现在已经克隆出的白介素有IL-1、IL-2、IL-6、IL-12、IL-15、IL-16、IL-17及IL-18等。本文就目前鸡白介素（IL-2）分子生物学与应用的研究进展做一综述。,.,IL-2:白细胞介素-2（Interleukins-2，IL-2）是一类由活化的T细胞分泌产生的糖蛋白，具有抗感染、抗病毒等功效，能够有效提高动物机体的免疫功能。1976年Morgan等以T细胞生长因子命名，在1979年5月正式命名为白细胞介素-2。医学上已经用于预防和治疗一些常规方法难以治疗的疾病如癌症、艾滋病等。对于家禽类，IL-2主要作为免疫佐剂配合疫苗使用，以提高疫苗的免疫效果，降低副反应，同时还具有免疫增强、免疫治疗等功能。由于IL-2是天然的细胞因子，不会造成体内的残留问题，对动物产品安全生产等方面具有广阔的应用前景。,.,人类IL-2基因于1983年被成功克隆后,30多个物种的IL-2基因被相继发现,鸡IL-2直到1997年才被SundickRS等克隆出来。鸡IL-2是鸡的白介素中研究最为深入的。LillehojJW等发现鸡IL-2真核表达质粒可增强艾美耳球虫基因免疫的效果,抑制球虫的复制。姜永厚等将含鸡IL-2基因的真核表达质粒作为佐剂与NDF基因疫苗混合免疫接种雏鸡,用标准强毒攻击,结果发现,添加IL-2质粒试验组免疫保护率明显高于单独接种NDF基因疫苗试验组。LowenthalJW等研究发现雏鸡注射鸡IL-2等细胞因子能增加IgA抗体的分泌水平和对疾病的抵抗力。于链等研究了IL-2质粒对传染性法氏囊病病毒的免疫增强作用。,.,第二部分白介素(IF-2)的分子生物学研究,.,Sundick等（1997）用ConA刺激鸡脾淋巴细胞构建了一个cDNA文库，转染COS-7细胞，通过瞬时表达，首次克隆出了鸡的IL-2基因。所克隆的鸡IL-2mRNA全长747bp，结构基因长343bp，根据氨基酸序列所推测的蛋白质长143个氨基酸。通过序列分析，该基因mRNA具有短的端非翻译区（），且该mRNA仅在激活的细胞中表达。根据核苷酸序列所推导的蛋白质含有一个短的信号序列，长22个氨基酸，该基因所编码的蛋白质含有个保守的半胱氨酸，可形成个链内二硫键，而哺乳动物只含有个半胱氨酸，形成个链内二硫键。,.,研究还发现，该基因靠近开放阅读框架的端有重复的序列。等（）采用技术获得了鸡IL-2基因全序列，对其基因组结构进行分析，发现该基因外含子和内含子结构与哺乳动物的极为相似，但前者的外含子及内含子和更短一些。在该基因外含子的端未翻译区有个重复的“不稳定”的重复序列。该基因是一个既无结构（氨基酸）又无启动子序列多态性的单拷贝基因，在该基因的启动子上发现有许多潜在的调节序列，序列比较还表明该基因上存在其他潜在的转录因子结合位点，这在哺乳动物IL-2启动子上至今未见报道，并在研究鸡IL-2基因结构的过程中，意外地发现了个多态现象，这可将该基因定位于鸡第号染色体上与相连，根据核苷酸序列所推导的氨基酸序列分析表明，该蛋白质结构是保守的，但是其受体结合位点并不保守.,.,李祥瑞（1995）利用鸡脾脏细胞，体外诱生IL-2，提取诱导过的脾单核细胞总，反转录合成，将核酸片段与质粒载体连接，质粒转化宿主菌，建立文库。经过两轮筛选，成功克隆了鸡IL-2，经序列分析表明，鸡IL-2与人和其他哺乳动物IL-2同源性在左右。李建荣等（2001）则是采用刺激体外培养的鸡淋巴细胞，应用方法得到地方品种萧山鸡IL-2，经研究发现，其全长为737，编码143个氨基酸，其与火鸡IL-2有69.4的同源性，与哺乳动物的IL-2有21.229.4的同源性。所编码的蛋白质预计包括22个氨基酸的前导序列和形成两个链内二硫键的个半胱氨酸。,.,陈吉刚等（2003）克隆了地方品种丝羽乌骨鸡IL-2，经研究发现，丝羽乌骨鸡IL-2基因由734碱基组成，编码一由143个氨基酸组成的前体蛋白。基因端含有个核苷酸和端含有个核苷酸组成的非编码区，中含有个重复的“”序列。张春杰等利用鸡新城疫系疫苗接种鸡胚，直接从鸡胚脾淋巴细胞中分离进行扩增得到了洛阳土种鸡IL-2。序列分析表明，洛阳土种鸡与中公布的鸡IL-2基因序列有个氨基酸的差异，尤其是、和个位点的氨基酸变异是其他品系鸡没有出现过的。,.,第三部分鸡IL-2在疾病防治中的应用研究,.,1免疫治疗剂,鸡IL-2作为免疫治疗剂应用于禽细菌性传染病和一些寄生虫病的报道不断出现。Tellez等使用由鸡ConA活化T细胞诱导产生的细胞因子，可以使鸡肠炎沙门氏菌器官侵入率降低51%60%，此种细胞因子注入鸡胚，同样可以显著降低孵化期鸡胚沙门氏菌器官侵入率。在寄生虫方面，Lillehoj等，在Eimeriatenella（柔嫩艾美球虫)感染鸡的前1d或感染后的第1天，用ConA活化鸡淋巴细胞产生的细胞因子处理鸡，谢昆等对ChIL-2的抗球虫作用做了初步研究，分别在14日龄和21日龄给试可以明显降低球虫感染鸡卵囊的排出量。验雏鸡胸部肌肉注射不同剂量的重组ChIL-2蛋白，28d龄口服接种1105个活球虫卵囊，结果表明，重组ChIL-2蛋白能降低相对卵囊产量、减少盲肠病变、提高相对增重。Lowenthal等研究发现，刚孵化出的小鸡的T淋巴细胞未发育成熟，在抗原的刺激下不能分化增殖和分泌IL-2，因此在小鸡2周龄注射IL-2可以提供一定的保护力。作为免疫治疗剂，IL-2还可以克服免疫抑制以及预防某些疾病感染，合理使用IL-2还可以克服饲料中的霉菌毒素等原因引起的免疫抑制。,.,2免疫增强剂,将IL-2与免疫源性弱的亚单位疫苗联合使用,可提高机体保护性免疫反应的水平。持续低剂量注射IL-2,有介导T细胞的作用,促进T细胞分裂、增殖。可增加外周血液中CD4T细胞数量,提高机体对抗原性的免疫应答能力。国内外学者进行了许多此方面的研究。Neil等(2000)采用IL-2与培养物过滤蛋白联合使用对牛的结核病进行免疫试验,结果显示,IL-2能作为一种佐剂提高亚单位苗的细胞免疫。并且,CFP-IL-2苗能减少肺部的损伤,相比之下,BCG疫苗就有较多的肺部坏死(Weinberg等,1988)。Numberg等(1989)报道,以IL-2和狂犬病灭活苗一起使用,攻毒后,疫苗对试验鼠的保护作用最少提高25倍,表明IL-2具有明显的佐剂效应(adjuvanticity)。,.,家禽类IL-2作为免疫增强剂已被许多学者所证实。杜明华利用毕赤酵母表达了重组ChIL-2，将纯化的ChIL-2与疫苗联合免疫鸡群，研究其作为免疫增强剂对禽流感病毒疫苗和新城疫病毒疫苗的免疫增强效果。实验表明，ChIL-2与禽流感或新城疫疫苗联合免疫均具有良好的免疫增强作用，能有效提高鸡体抗体滴度，提高存活率，其使用剂量约8.35g只。王彦彬等也研究了重组鸡IL-2对新城疫灭活疫苗的免疫增强效果，发现将重组IL-2和鸡新城疫灭活苗联合免疫8日龄固始鸡，能增强新城疫疫苗的免疫效果，提高血清中抗体的水平。此外，Tarpey等在鸡胚胎接种低剂量传染性法氏囊病和传染性支气管炎病毒疫苗时加入了重组火鸡疱疹病毒表达的鸡IL-2，结果显示，抗体对病毒的抑制作用明显增强，并且抵抗病毒的自我保护作用明显增加。表明，IL-2和低剂量疫苗联合免疫是增强卵内接种疫苗效果的有效、安全的方法。以上试验研究均表明了IL-2可以作为一种安全高效的免疫增强剂应用于禽类养殖业中。,.,3构建新型基因工程疫苗,早在DNA疫苗产生以前就有人把细胞因子作为佐剂与疫苗联用,但由于细胞因子在体内半衰期太短且造价昂贵,未能在传统疫苗中广泛应用。受DNA疫苗以质粒作为抗原载体的启发,以重组质粒表达的细胞因子克服了原有的弱点,而得以在DNA疫苗这个领域中得到更多的重视和研究,其中,以对IL-2的研究最为活跃。姜永厚等首次克隆得到的鸡IL-2与新城疫弱毒D26株F基因,经载体构建,将两者以非融合蛋白形式共同克隆于真核表达质粒pcDNA上,成功构建了表达鸡IL-2与新城疫F蛋白的重组质粒(pcDNA-F-IL-2),用此重组质粒免疫鸡,试验结果表明其表达IL-2可提高新城疫DNA疫苗的效力。Hazama等将IL-2基因与牛单纯性疱疹病毒糖蛋白D基因融合,真核细胞内表达融合蛋白,免疫小鼠后攻毒。结果该融合蛋白可完全保护小鼠免受病毒攻击,而以氢氧化铝为佐剂但不含IL-2的重组糖蛋白只产生部分保护,IL-2在体内的半衰期也因此延长大约4倍。表明采用此种方式获得IL-2抗原重组蛋白,是研制新一代基因工程苗的另一途径。,.,基因工程疫苗常把细胞因子基因与保护性抗原基因连接在一起，构成融合蛋白来增强疫苗的体液和细胞免疫水平。而禽类IL-2基因可以作为一个良好的细胞因子基因与保护抗原的基因连接在一起。前面提到了一些IL-2和IBDV的疫苗联合使用能提高IBDV疫苗的免疫原性的研究情况，而Wang等通过基因工程技术将IBDV病毒的VP2基因和鸡IL-2基因构建重组融合蛋白rVP2-IL-2，实验证实，rVP2-IL-2融合蛋白也能通过体液及细胞免疫来增强鸡体抵抗IBDV病毒的能力。Liu等也做了相关的研究，通过构建pBacPakVP2-IL-2质粒获得了融合蛋白VP2-IL-2。,.,Shah等将堆形艾美球虫的cSZ-2基因和chIL-2基因以及chIFN-基因分别导入真核表达载体pVAX1中，构建了pVAX1-cSZ2-chIL-2、pVAX1-cSZ2-chIFN-、pVAX1-cSZ2、pVAX1-chIL-2以及pVAX1-chIFN-重组基因工程疫苗，并发现pVAX1-cSZ2-chIL-2重组基因工程疫苗能使鸡体有较其他4个基因工程疫苗更强的免疫球虫病的能力，并能降低免疫应答过程中产生的对鸡肠组织损伤的程度。Song等优化了DNA疫苗pcDNA-TA4-IL-2的剂量及给药途径，采用肌肉注射25ug只时具有最好的免疫效果。闫若潜等研究了鸡基因工程重组复合抗病毒制剂对鸡病毒性疾病的作用，构建了ChIFN-linker-ChIL-2嵌合基因，其在大肠杆菌中表达的蛋白相对分子质量大小约35900，测定发现该重组蛋白在鸡胚成纤维细胞中具有明显抗病毒活性。免疫增强剂,.,第四部分鸡IL-2的表达途径,.,1鸡IL-2基因的发现及克隆1975年Morgan等用PHA刺激正常淋巴细胞,收集的细胞上清加入普通培养基用以培养正常骨髓细胞,发现这种培养基中含有一种具有维持骨髓T淋巴细胞在体外长期生长的物质,并把它命名为T细胞生长因子(TcGF)。1979年,瑞士国际淋巴因子会议统一把它命名为白细胞介素-2(IL-2)。虽然众多实验结果显示IL-2可以对多种细胞发挥显著的免疫作用,但是这种条件培养基中包含有其他的细胞因子,这就需要从这种培养基中分离出到单一的IL-2蛋白。为此研究人员尝试了多种纯化方法获得了纯度不一的天然IL-2蛋白。但这些纯化步骤只是相对的地提高了IL-2的纯度,并没有完全解决实验中其他因子污染的问题,而且纯化过程中外界因素也不可避免地对IL-2产生了影响。直到在1983年,日本人日本研究者口taniguchi和比利时研究者Devos在体外克隆和表达了人IL-2基因,这才使获得单一IL-2蛋白成为可能。,.,随后,研究人员分别克隆了鼠、牛和猪的IL一2基因。与人和哺乳动物相比,禽IL-2的研究相对滞后。直到1997年,Sundick等用构建cDNA文库的方法,才将鸡IL-2基因克隆成功。迄今,己有多种禽IL-2cDNA被成功克隆。,IL-2根据来源不同可以分为内源性IL-2和重组表达IL-2。前者生要来自新鲜的组织细胞,包括外周血淋巴细胞脾淋巴细胞和扁桃体淋巴细胞,这些细胞诱导后均可产生IL-2。迄今,人和鼠都建立了多个可以分泌IL-2的细胞系,但一些需要用PHA等抗原刺激诱导,而另一些不需要任何诱导就可以持续分泌IL-2,例如MLA-144细胞。,.,内源性IL-2,PHA/ConA刺激（淋巴）细胞(硫酸按)沉淀上清沉淀溶解除盐离子再用离子交换柱进行分离纯化，再次纯化。,.,重组表达IL-2,根据鸡IL-2基因所处的表达系统宿主细胞不同：1、大肠杆菌表达系统2、酵母表达系统3、哺乳动物细胞表达系统4、昆虫细胞表达系统。,.,展望目前，鸡已经由原来的基础研究向应用研究发展。随着生活水平的提高，人们对健康动物产品的需求越来越迫切，使用天然、绿色、无残留的生物制品作为动物生产、疾病预防以及治疗的