《刘文武毕业》PPT课件.ppt

吡那地尔联合硝酸甘油对兔缺血再灌注心肌保护作用的研究硕士研究生：刘文武责任导师：马宾,研究背景,缺血再灌注损伤,生活质量提高,老年人口增加,环境的改变,缺血性心血管疾病发病率逐年升高，严重威胁人类的健康,溶栓,心脏移植,PCI,CABG,缩短组织缺血时间、尽快恢复血流,缺血再灌注损伤,缺血及药物预处理,深入,保护缺血再灌注心肌、减轻其损伤,缺血预处理提出及其初期研究,1、mitoKATPC；2、热休克蛋白；3、核因子-KB；4、NaH交换体；5、NO作用；6、肌红蛋白作用；,发现,1、减轻心肌细胞的坏死、凋亡；2、保护血管内皮细胞；3、保护平滑肌细胞,证实,深入,临床操作难度大、风险高,设想,通过药物根据IPC机制而达到心肌保护作用,探索,证实,安全性高、操作方便容易控制的心肌保护新途径,思考,何种药物效果佳及其单用还是联合,试验选药及其设计,多项研究表明mitoKATP可能是IPC的共同终末途径,吡那地尔：氰胍类mitoKATPC开放药,大量实验证明，NO介导心肌保护发挥重要作用,硝酸甘油：外源性增加机体的NO含量,设想,单一药物预处理效果,联合用药会否更佳,材料与方法,材料-主要试剂、仪器,1、吡那地尔：sigma公司2、硝酸甘油：山西康宝生物制品股份有限公司。3、SOD、MDA、CK、NO和LDH试剂盒均为南京建成生物技术公司提供。4、伊文思蓝、氯化三苯基四氮唑BIOSHARP公司。5、小动物微型呼吸机：上海嘉鹏科技有限公司。6、MedLab生物信号采集处理系统：南京美易科技有限公司。,7、超低温冰箱海尔DW-86L626型，温度调节范围：-20-86。8、隔水式恒温培养箱上海一恒科技有限公司。9、离心机Centrifuge0406-1型上海手术器械厂。10、721分光光度计：上海凤凰光学科仪有限公司。,材料-实验动物,家兔50只，重量30.5kg，雌雄不限，由蚌埠医学院实验动物中心提供。,试验方法-分组,IR模型制作,家兔经耳缘静脉缓慢推注20%乌拉坦5ml/kg，背部及四肢固定于兔板上，分离气管、切开后插管，连接小动物微型呼吸机行机械通气，频率设置为50次/分，潮气量为10ml/kg，给予呼吸末正压通气，吸气与呼气之比为1:2，压力0.75-1.5kPa。经右颈总动脉切开置22号导管至左心室，连接40Kpa压力换能器监测血流动力学。四肢及胸部连接电极，监测胸导联及肢体导联心电图,开胸前准备,各时间段心电图表现,A,B,C,D,E,F,上图：家兔在缺血再灌注不同时间段心电图变化表现（胸导联，50min/s）（图A：正常家兔心电图表现；图B：结扎开始时心电图表现；图C：结扎40分钟心电图表现；图D：再灌注30分钟心电图表现；图E：结扎60分钟心电图表现；图F：结扎120分钟心电图表现）,典型心室内压曲线,开胸及冠脉结扎,胸骨左缘第4肋骨,剪断,打开胸腔分离心包暴露心脏,左冠状动脉主干、左心耳根部（以下2mm）,穿线,寻找,结扎观察心电图变化,心电图S-T段呈弓背样抬高明显、结扎线远端心肌呈现紫绀为结扎成功标准,成功,心肌梗死面积测定,实验结束后于冠脉原结扎点,胸骨左缘第3肋骨,剪断,钝性分离主动脉周围组织暴露主动脉，并用血管钳将其夹闭,原位结扎,左心室注入1%伊文思蓝2ml,心脏变蓝后将其取出，剔除心房及结缔组织,PBS漂洗,干净纱布吸去水分，置于-20冰箱30分钟,心脏切片,共约7或8片置于1TTC缓冲液(pH=7.4)，在37OC下染色15min,切片用10%甲醛溶液固定后照相,使用IPP软件处理缺血危险区占左心室的比例,心肌梗死图形表现,1、未缺血区域为蓝色2、危险区及梗死区为砖红色、灰白色或土黄色呈不规则、岛屿状分布。,标本收集,1、各组分别再灌注即刻、30min、60min、120min，从左侧股静脉抽取静脉血2ml，静置后离心分离血清，-80冰箱保存备用。检测SOD、MDA、NO、CK、LDH，均严格按试剂说明书进行2、各组分别于再灌注后30min、60min、90min、150分钟采集心室发展峰压（LVSP）等心室内压指标。将其数据导入excel便于实验结束后统计,统计学处理,实验数据用XS表示，采用随机区组设计的单因素方差分析，组间多重比较采用最小显著差法(LSD-t)。P0.05为差异有统计学意义。,实验结果,各组LVSP的比较,注：与I/R比0.05,0.01,与SO比0.01,与PIN0.01与NIT0.01。,各组LVEDP比较,注：与I/R比0.05,0.01,与SO比0.01,与PIN0.01与NIT0.01。,各组+dp/dtmax比较,注：与I/R比0.05,0.01,与SO比0.01,与PIN0.01与NIT0.01。,HR,注：与I/R比0.05,0.01,与SO比0.01,与PIN0.01与NIT0.01。,各组心肌梗死面积的比较,CK,LDH,SOD,MDA,NO,讨论,缺血再灌注损伤现象,兔心肌缺血再灌注,MDA、NO上升，SOD下降,CK、LDH上升,LVSP等的变化,心肌梗死面积的增加,1、线粒体呼吸链电子的终端受体氧水平降低；2、三磷酸腺苷(ATP)大量降解产生次黄嘌呤；3、氧自由基与钙超载互相作用,1、大量氧自由基的生成可使内源性防御机制对氧自由基的清除作用丧失；2、细胞因子、炎性介质活化、释放，激活中性粒细胞释放前炎症介质浸润受损心肌；3、大量Ca2+聚集,引起线粒体内膜上的通透性转换孔开放,硝酸甘油预处理,NIT预处理兔缺血再灌注心肌,MDA、NO下降，SOD上升（I/R,P0.05/0.01）,CK、LDH下降（I/R,P0.05/0.01）,LVSP、+dp/dmax上升，LVEDP下降（I/R,P0.05/0.01）,1、抑制氧自由基的大量生成；2抑制血小板趋化聚集黏附于血管内皮；3、直接作用于NADPH氧化酶表面膜元件；4、抑制中性粒细胞超氧因子的产生,钙依赖性钾通道的激话和PKGI的激活以及电压门控钙离子通道的抑制引起血管扩张,心肌梗死面积缩小,1、扩张冠状动脉，改善微循环；2、抑制内皮细胞TGF-1/Smad信号通路；3、作用域丝裂原活化蛋白激酶,吡那地尔预处理,PIN预处理兔缺血再灌注心肌,MDA、NO下降，SOD上升（I/R,P0.05/0.01）,CK、LDH下降（I/R,P0.05/0.01）,LVSP、+dp/dmax上升，LVEDP下降（I/R,P0.05/0.01）,心肌梗死面积缩小,1、使KATP通道活化、逆转钙超载、稳定细胞膜，保护线粒体的完整及功能；2、减少氧自由基的产生；3、抑制中性粒细胞的聚集；4、促发NO的生成,1、使冠脉平滑肌细胞内K+外流增加；2、降低血管平滑肌收缩成分对Ca2+的敏感性；3、影响细胞内磷酸化酶系统,1、减轻钙超载对心肌的损伤作用；2、使收缩活动减弱，以及减少心肌挛缩的发生，耗能减少,吡那地尔联合硝酸甘油预处理,联合预处理兔缺血再灌注心肌,MDA、NO下降，SOD上升（PIN/NIT,P0.05/0.01）,CK、LDH下降（PIN/NIT,P0.05/0.01）,LVSP、+dp/dmax上升，LVEDP下降（PIN/NIT,P0.05/0.01）,心肌梗死面积缩小,1、NO直接作用于KATP内部具有NO敏感性的氨基酸结合位点,开放KATP通道蛋白,或通过磷酸化蛋白激酶G升高cGMP水平,激活相关蛋白激酶,使心肌细胞的KATP开放增加；2、吡那地尔启动了机体内源性心肌保护物质激活NO-cGMP蛋白激酶G通路,激活一氧化氮合酶产生NO,结论,兔心肌组织存在缺血再灌注损伤，药物预处理对其有保护作用。硝酸甘油对缺血再灌注心肌有保护作用，与减少机体过氧化物的生成显著提高SOD/MDA的比例；扩张冠状动脉及心肌的微小血管改善心肌的供血减少心肌酶的释放量、缩小心肌梗死面积；同时在再灌注期间改善心功能提高射血指数有关。吡那地尔对兔缺血再灌注心肌有明显的保护作用，与提高缺血心肌的NO、SOD、降低MDA，提高SOD/MDA比例，降低氧自由基的大量生成；降低CK、LDH及心肌梗死面积，促进心功能指标的恢复有关。,硝酸甘油联合吡那地尔与单一药物比较保护心肌的效果更明显。可能与NO直接作用于KATP内部具有NO敏感性的氨基酸结合位点,开放KATP通道蛋白,或通过磷酸化蛋白激