醋酸纤维薄膜电泳实验技术的探讨 血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳

醋酸纤维薄膜电泳实验技术的探讨 血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳 摘要 醋酸纤维薄膜电泳由于操作简便、分辨力高和电泳时间短等优点,在很多方面被广泛应用。同时,醋酸纤维素薄膜电泳也被列为生物化学实验教学中的经典实验之一。本文根据多年来学生实验中电泳图谱不理想的情况,特重现学生经常出现的错误操作,从而和正确的操作得到的图谱进行对比,以便为以后得到的不理想图谱提供分析依据。 关键词 醋酸纤维薄膜 电泳 电泳图谱 电泳是生物化学的基本技术。电场力、微粒同支持介质相互作用、热运动扩散、缓冲液流动等对蛋白电泳的运动方向和速度都有影响。多种因素可引起缓冲液流动,电流引起的缓冲液流动称为电渗。但通常电场力决定蛋白质电泳行为,缓冲液流动对蛋白质电泳行为的影响太小而难观察到。血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳广泛用于临床检验和电泳的实验教学。正常条件下血清蛋白点样线靠近阴极端。实验过程中,许多实验者因不清楚点样方式、点样位置等,从而引起实验效果不够明显。本文设计一系列试验,对试验结果进行对比分析,并验证其原因,以期提高学生实验的成功率及电泳效果。 一、验器材及试剂 1.器材 DYY-5型稳压电泳仪(北京六一仪器厂)、DYY-38B电泳槽(北京六一仪器厂)、醋酸纤维素薄膜、新鲜鸡血清、滤纸、盖玻片、烧杯、量筒、容量瓶等。 2.试剂 巴比妥缓冲液(pH8.6离子强度为0.06mol/L);染色液;漂洗液。 二、试验方案及方法 1.试验方案 由于本试验过程中细微操作较多,现就试验中容易出现错误操作的步骤,设计了6个平行实验:(1)对照:正确操作;(2)倾斜点样;(3)在光滑面点样;(4)正确点样、搭桥时光滑面向下;(5)将浸润的薄膜吸干再点样;(6)正确点样、倾斜搭桥。 2.试验方法 (1)制作血清 用加有抗凝剂的一次性注射器抽取适量鸡血液,离心,得到新鲜鸡血清,放入4冰箱保存待用。 (2)滤纸桥的制做 根据电泳槽膜支架的宽度,剪裁尺寸合适的滤纸条。在两个电极槽中各倒入适量体积的缓冲液,在电泳槽的两个膜支架上,各放一层滤纸条,使滤纸一端的长边与支架前沿对齐,另一端浸入电极缓冲液中。当滤纸条全部润湿后,用玻璃棒轻轻挤压膜支架上的滤纸以驱赶气泡,使滤纸的一端紧贴在膜支架上。 (3)醋酸纤维薄膜的润湿与选择 用镊子取一膜条,在据一端1.5cm处画一条直线。之后,小心地平放在盛有缓冲液的培养皿中。若漂浮于液面的膜条在1530秒内迅速润湿,整条薄膜色泽深浅一致,则此膜条均匀,即可用于电泳;若膜条润湿缓慢,色泽深浅不一或有条纹及斑点,则表示薄膜厚薄不均匀应弃去,以免影响电泳结果。将选好的膜条用镊子轻压,使其完全浸泡于缓冲液中约510min后方可用于电泳。 (4)点样 用镊子取出浸透的薄膜,夹在两层滤纸间以吸去多余的缓冲液。无光泽面向上平放在点样模板上,使其底边与模板底边对齐,在铅笔划线处点样。点样时用盖玻片轻轻地印在点样区内并随即提取,使血清完全渗透于膜内,形成一定宽度、粗细均匀的直线。 (5)电泳 用镊子将点样的一端平贴在负极电泳槽支架的滤纸桥上,无光泽面朝下,另一端平贴在正极端的支架上。为了使膜条与电场平行,把膜条与电极之间压严,使膜条绷直,中间不下垂。如有很多膜条同时电泳时,膜条间应相距13mm,使之不互相接触,以免相干扰。盖严电泳室,平衡10min后方可通电。先调节粗调旋钮,然后调节细调旋钮。开始将电流强度调至0.3mA/cm膜宽,10min后调至0.5mA/cm膜宽,60min后停止电泳。 (6)染色 电泳完毕,立即取出薄膜,直接浸入染色液中染色5?10min。 (7)漂洗 将膜条从染色液中取出后,移置到漂洗液中漂洗约5次,至无蛋白区底色脱净为止。取出薄膜放在滤纸上,自然风干。 (8)结果观察 三、结果与分析 下图为相同电泳条件下,按照不同操作方式所获得的电泳图谱: (1)正确操作;(2)倾斜点样;(3)在光滑面点样;(4)正确点样、搭桥时光滑面向下;(5)将浸润的薄膜吸干再点样;(6)正确点样、倾斜搭桥(图中的4.1和5.1中1前的数字代表的是第四次和第五次重复)。 1.倾斜点样 通过几次试验的结果,对比1号、2号薄膜,我们发现,倾斜点样得到的谱带与正确操作得到的谱带并无太大差异。试验结果似乎表明,倾斜点样对最后获得的电泳谱带并无太大影响,这应该是让我们高兴的事情。可是这一结果却与带电颗粒在电场中的理论移动行为相悖离,也就是说同样的带电颗粒在同一电场中的移动速度不一致。为什么出现这一现象还需要大量实验和进一步分析。 2.在光滑面点样 通过试验结果拍摄的图片,对比1号、3号薄膜,我们发现,3号薄膜后落下了长长的尾巴,也就是出现了所谓的拖尾现象,所以血清点在光滑面是一个很严重的错误。由于薄膜光滑面为一层薄薄的聚乙烯,使得血清不能完全浸到粗糙面的乙酸纤维素内,电泳过程中同种血清蛋白流动也不一致,严重影响了试验结果。 3.光滑面向下搭桥 通过1号、4号的对比,可见光滑面向下搭桥电泳出的条带虽然区分不清晰,但仍能模糊分出5条带,只是条带之间的间距比正确操作得出的结果小的多。这是因为光滑面向下时,由于聚乙烯薄膜的阻挡作用,使通过薄膜的电流减小,血清蛋白流动变慢,从而导致了条带间距变小,试验结果也因此变得不理想。 4.浸润的薄膜吸得太干 1号和5号对比可以发现,薄膜太干导致条带难以分离,只出现了3条带。由于薄膜被吸的太干,电泳时电流不容易通过薄膜,被吸在薄膜上的血清蛋白也难以在薄膜上流动而难以分离,从而难以出现5条明显谱带。 5.搭桥时倾斜放置 带电的蛋白质离子在电场中是沿着电场的方向流动的,当薄膜倾斜时,理论上会向着薄膜长形的一条边聚集,然后再沿着边向阳极移动。所以6号薄膜电泳出的条带应该还是与点样线平行的,只是越靠近阳极条带越窄,和手机的信号显示差不多。 试验结果显示,6号薄膜仍能区分出5条谱带,除第一条条带有一些倾斜外,其余四条还是与点样线平行的。电泳谱带并没有像预期的那样向薄膜的一边聚集。这与倾斜点样一样,与理论有一定的出入,二者倒是都与薄膜的长轴方向一致,具体原因还需进一步的分析和验证。 四、讨论 用醋酸纤维薄膜作为区带电泳的支持物进行蛋白电泳有简便、快速、分辨能力强、没有吸附现象、便于保存等优点。但是由于操作不当、实验条件等原因,实验结果往往不够理想。此外,我们还发现,倾斜点样、倾斜搭桥对实验结果影响不明显,但该结果与理论分析相悖。对这一问题还需要进一步实验和探讨。 _: 1廖飞,王咏梅,左渝萍,何爱彬,曾昭淳.点样位置对血清蛋白醋酸纤