实验八不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳.ppt

实验八：不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳,贾跃腾罗世翔,实验八：不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳,贾跃腾罗世翔,一、不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳实验操作及注意事项（P138）,实验分组（每人做一管，每组配一份胶）认清试剂（试剂和吸管对号、量器的使用）封管分离胶配制与灌胶（浓度为6%，化学聚合，A1C2H2G5，每组总体积为10ml，灌胶高度为7-8cm）封正丁醇3mm（手法、高度、15min左右出现折光线时可进行下一步操作）,1.1分离胶的配制,注意事项：1、封管要严，防止漏液。2、固定玻璃管要竖直，防止夹碎。3、每组配一份胶，试剂与移液管对号，准确加量。4、配胶后立即灌胶（用滴管灌胶，用后立即清洗）5、正丁醇沿管壁缓缓加入,浓缩胶配制（浓度为3%，光聚合，B1D2E1F4，每组总体积为8ml）倒掉正丁醇灌浓缩胶（灌胶高度为1.5cm,上面留1cm空隙加样）封正丁醇3mm（观察界面，10分钟左右出现折光线时可倒去正丁醇）,1.2浓缩胶的配制,注意事项：1、倒掉正丁醇，用滤纸吸干再灌浓缩胶。2、配胶后立即灌胶（用滴管）3、灌胶后立即清洗滴管，防止胶凝固于管中。4、撕掉封口膜，用胶塞将玻璃管固定于电泳槽上（竖直，防漏）5、加电极缓冲液（注意液面）,安装电泳槽（结构、原理、电流及电极的方向、不漏水、除气泡）加buffer（没过上下管口）样品处理并加样（20ul）电泳（6mA/管，距底1cm时停止）剥胶固定（时间5min）染色（时间2min）漂洗脱色至背景透亮,1.3安装、加样、电泳,二、电泳基本原理及相关知识,2.1电泳的概念,带电粒子（胶体颗粒、离子等）在电场的作用下在特定的介质中向与其电荷性质相反的电极方向定向泳动的现象。广泛应用于生物大分子的分离和鉴定.,2.2电泳的基本原理,利用物质的两个差异来分离物质,1.电荷差异(1)电荷性质(2)电荷数量,2.分子差异(1)分子大小(2)分子形状,2.3电泳分离蛋白质的原理,蛋白质两性解离与等电点若向蛋白质溶液中加入适量的酸或碱，使羧基和氨基的解离度相同，此时溶液的pH值称为该蛋白质的等电点（PI）。2.溶液pH与蛋白质等电点决定蛋白质电荷性质与数量3.不同蛋白质分子大小和分子形状的差异,2.4实验室中常用到的电泳方法（以介质分类）,1.纸电泳：是最早使用的一种电泳技术，滤纸为支持物2.醋酸纤维膜电泳：醋酸纤维膜为其支持物3.凝胶电泳（1）琼脂糖凝胶电泳（2）聚丙烯酰胺凝胶电泳,三、聚丙烯酰胺凝胶电泳,3.1聚丙烯酰胺凝胶电泳原理聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamidegelelectrophoresis，简称PAGE)是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的一种常用电泳技术。1、聚丙烯酰胺凝胶由单体丙烯酰胺和甲基双丙烯酰胺聚合而形成的三维网状结构，聚合过程由自由基催化完成。2、催化聚合的常用方法有两种：化学聚合法和光聚合法。(1)在化学聚合过程中，以过硫酸铵（AP）为催化剂，以四甲基乙二胺（TEMED）为加速剂,TEMED催化AP产生自由基；(2)在光聚合过程中，以核黄素为催化剂，光催化核黄素产生自由基。自由基引发丙烯酰胺单体聚合，同时甲基双丙烯酰胺与丙烯酰胺链间产生甲基键交联，从而形成三维网状结构。,3.2聚丙烯酰胺凝胶的特性(1)在一定浓度时，凝胶透明，有弹性，机械性能好；(2)化学性能稳定，与被分离物不起化学反应，在很多溶剂中不溶；(3)对pH和温度变化较稳定；(4)几乎无吸附和电渗作用，只要Acr纯度高，操作条件一致，则样品分离重复性好；(5)样品不易扩散，且用量少，其灵敏度可达10-6g(6)凝胶孔径可调节，根据被分离物的分子量选择合适的浓度，通过改变单体及交联剂的浓度调节凝胶的孔径；(7)分辨率高，尤其在不连续凝胶电泳中，集浓缩、分子筛和电荷效应为一体。因而较醋酸纤维薄膜电泳、琼脂糖电泳等有更高的分辨率。,3.3聚丙烯酰胺凝胶电泳的分类1.根据其有无浓缩效应，分为：（1）连续系统连续系统电泳体系中缓冲液pH值及凝胶浓度相同，带电颗粒在电场作用下，主要靠电荷和分子筛效应（2）不连续系统不连续系统中由于缓冲液离子成分，pH，凝胶浓度及电位梯度的不连续性，带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应，分子筛效应，还具有浓缩效应，因而其分离条带清晰度及分辨率均较前者佳。2.根据蛋白质样品变性与否，分为：（1）变性电泳也就是SDS-PAGE，蛋白质失去二三级结构；（2）非变性电泳蛋白质能够保持完整状态，并依据蛋白质的分子量大小、蛋白质的形状及其所附带的电荷量而逐渐呈梯度分开。3.根据电泳槽体系的类型，分为：（1）圆盘电泳（2）板状电泳两者电泳原理完全相同。,四、变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）,SDS-PAGE仅根据蛋白质亚基分子量的不同就可以分开蛋白质。该技术最初由shapiro于1967年建立，他们发现在样品介质和丙烯酰胺凝胶中加入离子去污剂和强还原剂后，蛋白质亚基的电泳迁移率主要取决于亚基分子量的大小（可以忽略电荷因素），其原理在于：1.去电荷：由于SDS（十二烷基硫酸钠）产生的十二烷基硫酸根带负电，使各种蛋白质-SDS复合物都带上相同密度的负电荷，它的量大大超过了蛋白质分子原的电荷量，因而掩盖了不同种蛋白质间原有的电荷差别；2.破坏结构：SDS能断裂分子内和分子间的氢键，使分子去折叠，破坏蛋白分子的二、三级结构。如果蛋白质是由不同的亚基组成的，它在电泳中可能会形成分别对应于各个亚基的几条带；3.统一构象：SDS与蛋白质结合后，还可引起构象改变，蛋白质-SDS复合物形成近似“雪茄烟”形的长椭圆棒，不同蛋白质的SDS复合物的短轴长度都一样，约为18A；这样的蛋白质-SDS复合物，在凝胶中的迁移率，不再受蛋白质原来的电荷和形状的影响，而取决于分子量的大小。,SDS-PAGE的原理,四、不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳,4.1不连续PAGE的原理,三个不连续三个效应,凝胶孔径不同缓冲液pH不同缓冲液离子成分不同,浓缩效应电荷效应分子筛效应,4.2不连续体系的组份不连续体系由浓缩胶、分离胶及电极缓冲液所组成。1.浓缩胶是由核黄素催化聚合而成的大孔胶，凝胶缓冲液为pH6.7的Tris-HC1。2.分离胶是由AP催化聚合而成的小孔胶，凝胶缓冲液为pH8.9Tris-HC1。3.电极缓冲液是pH8.3Tris-甘氨酸缓冲液。2种孔径的凝胶、2种缓冲体系、3种pH值使不连续体系形成了凝胶孔径、pH值、缓冲液离子成分的不连续性，这是样品浓缩的主要因素。,4.3样品浓缩效应1.凝胶孔径不连续性；2.缓冲体系离子成分及pH值的不连续性；在pH6.7的凝胶缓冲体系中前导离子或快离子：HC1解离出的氯根(C1-)尾随离子(trailingion)或慢离子：甘氨酸根mclclmppmGG(Cl代表氯根，P代表蛋白质，G代表甘氨酸根)有效迁移率=m，m为迁移率，为解离度)当进入pH8.9的分离胶时，甘氨酸解离度增加，其有效迁移率超过蛋白质；3.电位梯度的不连续性。,Gly-,Pro-,Cl-,Gly-,Pro-,Cl-,Cl-,Cl-,Cl-,Pro-,Pro-,Pro-,Gly-,Gly-,Gly-,pH为8.3的电泳缓冲液（Tris-Gly）,pH为6.7的浓缩胶,pH为8.9的分离胶,有效泳动率：MCl-MPro-MGly-,6%胶,3%胶,有效泳动率：MCl-MGly-MPro-,五、实验结果的分析,5.1相关理论,表-1血清中各蛋白质的相关特