《分子克隆技术》PPT课件

分子克隆技术,分子克隆（molecularcloning）又称为基因克隆、基因工程、DNA克隆、重组DNA技术,克隆（Clone）指通过无性繁殖过程所产生的与亲代完全相同的子代群体。,分子克隆指按照人的意愿，在体外将某种生物的DNA片断插入到载体（质粒、病毒等）中，形成遗传物质的新组合-重组DNA分子（重组子），然后将重组子转移到宿主细胞中进行复制或表达，即对DNA分子进行克隆，以获得该DNA分子的大量拷贝。,基本原理：将编码某一多肽或蛋白质的基因（外源基因）组装到细菌质粒（质粒是细菌染色体外的双链环状DNA分子）中，再将重组质粒转入大肠杆菌，这样重组质粒就随大肠杆菌的增殖而复制，从而克隆基因或表达出外源基因编码的相应多肽或蛋白质。,Asaresultofthiswork,PaulBergsharedthe1980NobelPrizeinChemistrywithWalterGilbertandFrederickSangerforfundamentalstudiesofthebiochemistryofnucleicacids,withparticularregardtorecombinant-DNA.,AtStanfordBergandhiscolleaguessplicedtwoDNAmoleculestogetherinvitroandwereabletoinsertasetofthreegenesresponsibleformetabolizinggalactoseinEscherichiacoliintotheSV40DNAgenome.,ThisworkledtotheemergenceofrecombinantDNAtechnologyandprovidedamajortoolforanalyzingmammaliangenestructureandfunction.,大肠杆菌转化体系的建立：感受态菌制备经氯化钙处理的大肠杆菌能够摄取质粒DNA。,1.双抗性（TerKar)重组质粒DNA及双抗性转化大肠杆菌细胞的获得。,2.真核动物非洲爪蟾的基因在原核细胞中转录,意义：1.解决了无复制能力的DNA片断在宿主细胞中进行繁殖克隆的关键问题；2.质粒分子可作为基因克隆的载体将外源DNA分子导入宿主细胞；3.真核细胞的基因可被转移到原核细胞中进行克隆及表达。,分子克隆中的关键技术：DNA分子的分离和富集技术；DNA分子的切割与连接技术；载体构建技术；大肠杆菌转化技术；重组DNA分子的筛选和鉴定技术,分子克隆的基本步骤：1.目的基因的获得2.目的基因与载体的连接3.重组DNA分子导入受体细胞4.筛选出含重组DNA分子的受体细胞克隆5.克隆基因、克隆基因的表达,载体特征：1.能自主复制的复制子2.可供筛选的遗传标记3.适当大小的分子量4.合适的限制性内切酶位点，方便外源基因的插入5.在受体细胞中高效复制,TA克隆的idea最初来自1994年。几位学者发现TaqDNA聚合酶在PCR产物的3末端加上一个脱氧腺苷（A），而且这种特性与模板无关。之后，invitrogen公司发明了TA克隆技术，并拥有全球TAcloning商标的专利权。线性化