第七章核酸及核酸代谢

第七章核酸的生物化学,Chapter7BiochemistryofNucleicAcid,第一节核酸的结构与功能,Section1StructureandFunctionofNucleicAcid,Whatsnucleicacid?,核酸的发现：1869年瑞士米歇尔核酸的定义：生物体内一类含有磷酸基团的重要生物大分子（酸性物质），是遗传变异的物质基础，是遗传信息的载体，在蛋白质的生物合成中起重要的作用。,核糖核酸(ribonucleicacid,RNA)RNA主要参与遗传信息的表达;脱氧核糖核酸(deoxyribonucleicacid,DNA)DNA是遗传信息的载体;,核酸的分类：,RNA和DNA都是以单核苷酸(nucleotide)为基本单位所组成的多核苷酸长链。,1.1TheChemicalComponentandPrimaryStructureofNucleicAcid,1.1核酸的化学组成及一级结构,核酸的水解产物：,1.嘧啶碱(pyrimidine)：,一、核苷酸中的碱基组成,2.嘌呤碱(purine)：,二、戊糖与核苷,1戊糖(pentose)：,2核苷(nucleoside)：,核苷是由戊糖与含氮碱基经脱水缩合而生成的化合物。在大多数情况下，核苷是由核糖或脱氧核糖的C1-羟基与嘧啶碱N1或嘌呤碱N9进行缩合，故生成的化学键称为，N糖苷键。,碱基和核糖的缩合物，以N-糖苷键相连；成苷位置：核糖C-1与嘧啶N-1；核糖C-1与嘌呤N-9。核苷：腺苷A，鸟苷G，胞苷C，尿苷U；脱氧核苷：脱氧腺苷dA,脱氧鸟苷dG,脱氧胞苷dC,脱氧胸苷dT；,2核苷(nucleoside)：,“稀有核苷”是由“稀有碱基”所生成的核苷。,三、核苷酸的结构与命名,核苷酸(nucleotide)是由核苷与磷酸经脱水缩合后生成的磷酸酯类化合物，包括:核糖核苷酸:5-AMP,5-GMP,5-CMP,5-UMP脱氧核糖核苷酸:5-dAMP,5-dGMP,5-dCMP,5-dTMP与磷酸基缩合的位置：2-核苷酸、3-核苷酸和5-核苷酸。最常见的核苷酸是5-核苷酸（5常被省略）,5-核苷酸的分子结构,5-核苷酸又可按其在5位缩合的磷酸基的多少，分为一磷酸核苷（核苷酸）、二磷酸核苷和三磷酸核苷。,环核苷酸的分子结构,环一磷酸腺苷环一磷酸鸟苷,核苷酸的命名及缩写符号,细胞内游离核苷酸及其衍生物,1、含高能磷酸键的ATP类化合物；ATP是能量的直接供体；（脱氧）核苷三磷酸是合成RNA和DNA的原料；ATP、GTP、CTP、TTP、UTP；ADP、GDP、CDP、TDP、UDP；参加合成代谢；UTP-糖类合成、GTP-蛋白质合成、CTP-脂类合成2、环状核苷酸（cAMP、cGMP）第二信使，影响多种酶的活性,四、核苷酸的性质,一般物理性质；互变异构现象；紫外吸收，260nm；核苷酸的两性解离和等电点；,互变异构现象,uracil酮式,uracil烯醇式,碱基的紫外吸收,最大吸收峰在260nm附近,胞嘧啶核苷酸的解离,核苷酸的两性解离和等电点,4种核苷酸的解离曲线,可在pH2.05.0之间分离各种核苷酸,pH3.5时各核苷酸所带电荷,（四）细胞内游离核苷酸及其衍生物,1、含高能磷酸键的ATP类化合物；ATP是能量的直接供体；（脱氧）核苷三磷酸是合成RNA和DNA的原料；ATP、GTP、CTP、TTP、UTP；ADP、GDP、CDP、TDP、UDP；参加合成代谢；UTP-糖类合成、GTP-蛋白质合成、CTP-脂类合成2、环状核苷酸（cAMP、cGMP）,五、核酸的一级结构,一分子核苷酸的3-位羟基与另一分子核苷酸的5-位磷酸基通过脱水可形成3,5-磷酸二酯键，从而将两分子核苷酸连接起来。,3,5-磷酸二酯键的形成,多核苷酸链,核酸就是由许多核苷酸单位通过3,5-磷酸二酯键连接起来形成的不含侧链的长链状化合物。核酸是的方向性：多核苷酸链的两端，一端称为5-端，另一端称为3-端。,多核苷酸链简写方法,书写方向规定为：5-端3-端。,DNA分子：由dAMP、dGMP、dCMP和dTMP组成。DNA的一级结构就是指DNA分子中脱氧核糖核苷酸的排列顺序及连接方式(3,5-磷酸二酯键)。RNA分子：由AMP，GMP，CMP，UMP组成。RNA的一级结构就是指RNA分子中核糖核苷酸的排列顺序及连接方式。,核酸的一级结构,DNA的一级结构：5-AGTCCATG-3AGTCCATG3-TCAGGTAC-5RNA的一级结构：5-AGUCCAUG-3AGUCCAUG,核酸一级结构的表示方法,水解方式：酶法、碱法和酸法（1）碱水解RNA2-核苷酸+3-核苷酸DNADNA变性但不被水解（2）酸水解DNA无嘌呤的DNA分子（pH4）DNA（RNA）碱基+戊糖+磷酸（强酸高温）,核酸的水解作用,（3）核酸酶的水解作用核酸酶-水解核酸磷酸二酯键的酶种类根据底物不同分三类：脱氧核糖核酸酶（DNase）核糖核酸酶（RNase）核酸酶（Nuclease）根据核酸酶对底物作用特点分核酸内切酶、核酸外切酶,核酸的水解作用,1.2DNA的空间结构与功能,1.2DimensionalStructureandFunctionofDNA,一、DNA的二级结构双螺旋结构模型,DNA双螺旋结构是DNA二级结构的一种重要形式，它是Watson和Crick两位科学家于1953年提出来的一种结构模型（获1962年度诺贝尔奖）。,JamesWatson(L)andFrancisCrick(R),andthemodeltheybuiltofthestructureofDNA,（一）对DNA双螺旋结构模型作出贡献的科学家,1.OswaldAvery(1877-1955)MicrobiologistAveryledtheteamthatshowedthatDNAistheunitofinheritance.OneNobellaureatehascalledthediscoverythehistoricalplatformofmodernDNAresearch,andhisworkinspiredWatsonandCricktoseekDNAsstructure.Nature,2003,2.ErwinChargaff(1905-2002)ChargaffdiscoveredthepairingrulesofDNAletters,noticingthatAmatchestoTandCtoG.Helatercriticizedmolecularbiology,thedisciplinehehelpedinvent,asthepracticeofbiochemistrywithoutalicence,andoncedescribedFrancisCrickaslookinglikeafadedracingtout.Nature,2003,Chargaff研究小组的贡献,19501953，Chargaff研究小组对DNA的化学组成进行了分析研究，发现：DNA碱基组成有物种差异，且物种亲缘关系越远，差异越大；相同物种，不同组织器官中DNA碱基组成相同，而且不因年龄、环境及营养而改变；DNA分子中四种碱基的摩尔百分比具有一定的规律性，即A=T、G=C、A+G=T+C。这一规律被称为Chargaff规则。,3.LinusPauling(1901-1994)Thetitanoftwentieth-centurychemistry.Paulingledthewayinworkingoutthestructureofbigbiologicalmolecules,andWatsonandCricksawhimastheirmaincompetitor.Inearly1953,workingwithoutthebenefitofX-raypictures,hepublishedapapersuggestingthatDNAwasatriplehelix.Nature,2003,4.RosalindFranklin(1920-1958)Franklin,trainedasachemist,wasexpertindeducingthestructureofmoleculesbyfiringX-raysthroughthem.HerimagesofDNA-disclosedwithoutherknowledge-putWatsonandCrickonthetracktowardstherightstructure.Shewentontodopioneeringworkonthestructuresofviruses.Nature,2003,5.MauriceWilkins(1916-)LikeCrick,NewZealand-bornWilkinstrainedasaphysicist,andwasinvolvedwiththeManhattanprojecttobuildthenuclearbomb.WilkinsworkedonX-raycrystallographyofDNAwithFranklinatKingsCollegeLondon,althoughtheirrelationshipwasstrained.HehelpedtoverifyWatsonandCricksmodel,andsharedthe1962Nobelwiththem.Nature,2003,1953年由Franklin和Wilkins等人完成的研究工作，发现了DNA晶体的X线衍射图谱中存在两种周期性反射，并证明DNA是一种螺旋构象。,Fig.51,6.JamesWatson(1928-)WatsonwenttouniversityinChicagoaged15,andteamedupwithCrickinCambridgeinlate1951.Aftersolvingthedoublehelix,hewentontoworkonvirusesandRNA,anothergeneticinformationcarrier.Healsohelpedlaunchthehumangenomeproject,andispresidentofColdSpringHarborLaboratoryinNewYork.Nature,2003,7.FrancisCrick(1916-2004)Cricktrainedandworkedasaphysicist,butswitchedtobiologyaftertheSecondWorldWar.Afterco-discoveringthestructureofDNA,hewentontocrackthegeneticcodethattranslatesDNAintoprotein.HenowstudiesconsciousnessatCaliforniasSalkInstitute.Nature,2003,典型的双链DNA二级结构,DNA右手双螺旋结构模式的设计者：Watson与Crick，1953年。设计主要依据：（1）对DNA分子X射线衍射图分（2）碱基摩尔含量的比率关系（3）四种碱基的理化数据分析,（二）DNA双螺旋结构模型的要点：,目前已知DNA双螺旋结构可分为：A、B、C、D（右手双螺旋）Z型（左手双螺旋）,B型DNA双螺旋结构模式图,（二）DNA双螺旋结构模型(B型)的要点：,(1)两条反向平行的多核苷酸链围绕同一中心轴形成右旋的双螺旋结构。(2)碱基位于双螺旋的内侧，平面垂直于中心轴；磷酸和核糖在外侧，糖平面平行于中心轴；(3)碱基配对原则：A=T(2)，G=C(3)；(4)螺旋参数：每螺旋10对,螺距3.4nm；螺旋直径2.0nm;(5)小沟，大沟；,碱基配对及氢键形成,B型双螺旋DNA的结构特征,（二）DNA双螺旋结构模型(B型)的要点：,(6)螺旋的稳定因素：氢键碱基堆积力碱基对平面垂直于中心轴,层叠于双螺旋的内侧.疏水性碱基堆积在一起相互吸引形成碱基堆积力。离子键DNA分子的大小：碱基对（bp）、分子量,二、DNA的三级超螺旋结构及在染色质中组装,超螺旋结构(superhelix或supercoil)DNA双螺旋链再盘绕即形成超螺旋结构。正超螺旋(positivesupercoil)盘绕方向与DNA双螺旋方同相同。负超螺旋(negativesupercoil)盘绕方向与DNA双螺旋方向相反。,绝大多数原核生物的DNA都是共价封闭的环状双螺旋。如果再进一步盘绕则形成麻花状的超螺旋结构。,（一）原核生物DNA的高级结构：,（二）DNA在真核生物细胞核内的组装：,在真核生物中，双螺旋的DNA分子围绕一蛋白质八聚体进行盘绕，从而形成特殊的串珠状结构，称为核小体(nucleosome)。核小体结构属于DNA的高级结构。,核小体的结构,核小体、染色质与染色体,三、DNA的功能,DNA的基本功能是作为遗传信息的载体，为生物遗传信息复制以及基因信息的转录提供模板。,DNA分子中具有特定生物学功能的片段称为基因（gene）。一个生物体的全部DNA序列称为基因组（genome）。基因组的大小与生物的复杂性有关，如病毒SV40的基因组大小为5.1103bp，大肠杆菌为5.7106bp，人为3.2109bp。,1.3RNA的结构与功能,1.3StructureandFunctionofRNA,RNA在蛋白质生物合成过程中起着重要的作用RNA通常以单链形式存在，但也可形成局部的双螺旋结构。RNA分子的种类较多，分子大小变化较大，功能多样化。主要的RNA种类有rRNA、mRNA、tRNA、HnRNA、SnRNA、SnoRNA、ScRNA等。,一、RNA的种类、分布与功能,一、RNA的种类、分布与功能,（1）细胞质中的RNA核糖体RNA（ribosomalRNA,rRNA）转运RNA（transferRNA,tRNA）信使RNA（messageRNA,mRNA）小胞浆RNA（scRNA,smallcytosolRNA）线粒体RNA叶绿体RNA（2）细胞核中的RNAhnRNA(heterogeneousnuclearRNA)不均一RNAsnRNA(smallnuclearRNA),小核RNA；chRNA(chromosomeRNA),染色体RNA；（3）病毒RNA,RNA的种类、分布与功能,mRNA、rRNA、tRNA的功能,mRNA分子中带有遗传密码，其功能是为蛋白质的合成提供模板(templet)。mRNA分子中每三个相邻的核苷酸组成一组，在蛋白质翻译合成时代表一个特定的氨基酸，这种核苷酸三联体称为遗传密码（coden)。rRNA是细胞中含量最多的RNA，占总量的80%。rRNA与蛋白质一起构成核蛋白体，作为蛋白质生物合成的场所。tRNA在蛋白质的生物合成过程中转运氨基酸。,二、tRNA的结构,tRNA是分子最小，但含有稀有碱基最多的RNA，其稀有碱基的含量可多达20%。tRNA是保守性最强的RNA。tRNA是单链核酸，但其分子中的某些局部也可形成双螺旋结构。,（一）tRNA的二级结构：,tRNA的二级结构由于局部双螺旋的形成而呈现“三叶草”形，故称为“三叶草”结构。tRNA的“三叶草”形结构包括：氨基酸臂、DHU臂、反密码臂、可变臂和TC臂五部分。靠氢键维持稳定性。,携带氨基酸,辨认并结合氨基酰tRNA合成酶,识别mRNA上的密码,识别并结合核蛋白体,氨基酸臂,DHU臂,反密码臂,可变臂,TC臂,（二）tRNA的三级结构（倒L型）：,氨基酸接受臂与反密码子环分别位于两端；分子上有两个双螺旋区；构象靠非螺旋区的碱基之间的氢键维持。,例题：1双链DNA分子量为3107，计算：aDNA的长度b含多少圈螺旋c分子的长度（每对核苷酸残基平均分子量为618）解：aL=3107/6180.34bn=3107/61810cV=3.141.023107/6180.34,例题2:已知某DNA溶液,碱基A占16%,求其余碱基所含的比例。解：因为，A=T，G=C所以，T=A=16%G=C=50%-16%=34%例题3：已知DNA分子的一条链碱基顺序为：3GCTACGA,写出其互补链的碱基顺序。,第二节核酸的理化性质、变性和复性及其应用,Section2ThePhysicalandChemicalCharacters,DenaturationandRenaturationofNucleicAcid,aswellastheirApplications,一、核酸的一般理化性质,两性解离/一般呈酸性（在中性溶液中带负电荷），微溶于水，不溶于有机溶剂线性大分子（粘度高,抗剪切力差）可用电泳或离子交换（色谱）进行分离室温条件下，DNA在碱中变性，但不水解，RNA水解加热条件下，D核糖浓盐酸苔黑酚绿色D2脱氧核糖酸二苯胺蓝紫色,二、核酸的紫外吸收特性,1、紫外吸收性质max=260nm2、应用以A260/A280进行定性、定量及纯度测定：纯DNA:A260/A2801.8纯RNA:A260/A2802.0,二、核酸的紫外吸收特性,1、紫外吸收性质max=260nm2、应用以A260/A280进行定性、定量及纯度测定：纯DNA:A260/A2801.8纯RNA:A260/A2802.0DNA和RNA溶液中加入溴化乙锭（EB），在紫外下发出荧光,二、核酸的紫外吸收特性,1、紫外吸收性质max=260nm2、应用以A260/A280进行定性、定量及纯度测定：纯DNA:A260/A2801.8纯RNA:A260/A2802.0DNA和RNA溶液中加入溴化乙锭（EB），在紫外下发出荧光减色效应,三、DNA的变性,天然核酸在理化因素作用下，其双螺旋的氢键断裂，碱基堆积力不再存在，DNA双螺旋的两条互补链松散而分开成为无规则线团状的单链DNA单链现象称为DNA的变性(denaturation)。引起DNA变性的因素：高温，强酸强碱，有机溶剂等。,增色效应(hyperchromiceffect)：指DNA变性后对260nm紫外光的光吸收度增加的现象；旋光性下降；粘度降低；生物学功能丧失或改变。,DNA变性后的性质改变：,加热DNA溶液，使其对260nm紫外光的吸收度突然增加，达到其最大值一半时的温度，就是DNA的变性温度（融解温度，meltingtemperature,Tm）。,DNA的变性温度,Tm的高低与DNA分子中G+C的含量有关，G+C的含量越高，则Tm越高。,四、DNA的复性与分子杂交,将热变性后的DNA溶液缓慢冷却，在低于变性温度约2530的条件下保温一段时间（退火annealing），则变性的两条单链DNA可以重新互补而形成原来的双螺旋结构并恢复原有的性质。将变性DNA经退火处理，使其重新形成双螺旋结构的过程，称为DNA的复性。,DNA复性后，一系列性质将得到恢复，但是生物活性一般只能得到部分的恢复，具有减色效应。将热变性的DNA骤然冷却至低温时，DNA不可能复性。变性的DNA缓慢冷却时可复性，因此又称为“退火”。退火温度Tm25复性影响因素片段浓度/片段大小/片段复杂性（重复序列数目）/溶液离子强度,DNA的复性,两条来源不同的单链核酸（DNA或RNA），只要它们有大致相同的互补碱基顺序，经退火处理即可复性，形成新的杂种双螺旋，这一现象称为核酸的分子杂交(hybridization)。,核酸的分子杂交(hybridization),核酸杂交可以是DNA-DNA，也可以是DNA-RNA杂交。不同来源的，具有大致相同互补碱基顺序的核酸片段称为同源顺序(homologoussequence)。,DNA-DNA杂交示意图,DNA-RNA杂交示意图,利用核酸的分子杂交，可以确定或寻找不同物种中具有同源顺序的DNA或RNA片段。常用的核酸分子杂交技术有：原位杂交、斑点杂交、Southern杂交及Northern杂交等。,五、核酸的含量与纯度测定（一）核酸含量的测定1、定磷法2、定糖法（二）DNA纯度的鉴定1、紫外吸收2、凝胶电泳,六、核酸的分离、纯化,（一）核酸的工业化生产（二）活性核酸的制备注意一般原则：低温(0-4)，避免强酸、强碱和剧烈搅拌；抑制核酸酶的作用；用有机溶剂抽提以去除蛋白；乙醇沉淀；,抑制DNase：,可加柠檬酸钠、EDTA等金属螯合剂；或加去污剂十二烷基硫酸钠（SDS）；或加蛋白变性剂。,抑制RNase：,（1）实验器皿高温，或高压灭菌，不能高压灭菌的用具用0.1%二乙基焦碳酸盐（diethylpyrocarbonate,DEPC）处理。,（2）加强的蛋白变性剂如硫氰酸胍、异硫氰酸胍等。,（3）加核糖核酸酶阻抑蛋白（RNasin）等RNase的抑制剂。,3DNA-蛋白质（DNP）的提取,真核细胞DNA与蛋白质结合成核蛋白（DNP），RNA与蛋白质结合成RNP，而且DNP和RNP常常混在一起。利用DNP和RNP在不同浓度NaCl中溶解度的不同来分离DNP和RNP。,可用1mol/LNaCl溶液提取DNP。,相对溶解度,NaCl（mol/L）,DNP在NaCl中的溶解度,大分子DNA的提取,1材料的选择,2细胞破碎,4去蛋白质,（1）SDS,（2）苯酚法,（3）氯仿法,（4）酚:氯仿:异戊醇25:24:1,5沉淀DNA,6去杂质,（1）去RNA,（2）去多糖,7进一步纯化,生物材料,DNP（RNP）,DNP,纤维状DNA,较纯DNA,纯DNA,*原核生物的DNA是裸露的，与蛋白质结合不多，分离纯化要简单些。,破细胞,1.0mol/LNaCl*,去蛋白质,酒精沉淀,去RNA,柱层析，电泳,密度梯度离心,去多糖,第三节核苷酸代谢,Section3Metabolismofnucleotides,核苷酸(nucleotide)是构成核酸(nucleicacid)的基本单位，人体所需的核苷酸都是由机体自身合成的。食物中的核酸或核苷酸类物质基本上不能被人体所利用。在核酸类物质的水解产物中，只有磷酸和戊糖可被吸收利用。,食物中核酸的消化,3.1嘌呤核苷酸的代谢,3.1MetabolismofPurineNucleotides,一、嘌呤核苷酸的合成代谢,通过利用一些简单的前体物，如5-磷酸核糖，氨基酸，一碳单位及CO2等，逐步合成嘌呤核苷酸的过程称为从头合成途径(denovosynthesis)。这一途径主要见于肝，其次为小肠和胸腺。所有合成反应在胞液中进行。,（一）嘌呤核苷酸的从头合成：,嘌呤碱合成的元素来源,嘌呤核苷酸合成途径：,1、5-磷酸核糖活化为5-磷酸核糖-1-焦磷酸（PRPP）2、IMP的合成3、由IMP转变成AMP，GMP,次黄苷酸的合成：首先在磷酸核糖焦磷酸合成酶的催化下，消耗ATP，由5-磷酸核糖合成PRPP(1-焦磷酸-5-磷酸核糖)。PRPP再经过大约10步反应，合成第一个嘌呤核苷酸次黄苷酸（IMP）。,1从头合成途径：,次黄苷酸（IMP）的合成,合成过程,腺苷酸及鸟苷酸的合成：IMP在腺苷酸代琥珀酸合成酶的催化下，由天冬氨酸提供氨基合成腺苷酸代琥珀酸（AMP-S），然后裂解产生腺苷酸（AMP）。IMP也可在IMP脱氢酶的催化下，以NAD+为受氢体，脱氢氧化为黄苷酸（XMP），后者再在鸟苷酸合成酶催化下，由谷氨酰胺提供氨基合成鸟苷酸（GMP）。,腺苷酸（AMP）与鸟苷酸（GMP）的合成,三磷酸嘌呤核苷的合成：,核糖核苷酸还原酶的作用机制,又称再利用合成途径(salvagepathway)。指利用分解代谢产生的自由嘌呤碱合成嘌呤核苷酸的过程。这一途径可在大多数组织细胞中进行。,（二）嘌呤核苷酸的补救合成：,嘌呤核苷酸的补救合成过程,二、嘌呤核苷酸的分解代谢,嘌呤核苷酸的分解首先是在核苷酸酶的催化下，脱去磷酸生成嘌呤核苷，然后再在核苷酶的催化下分解生成嘌呤碱，最后在黄嘌呤氧化酶的作用下氧化生成尿酸(uricacid)，再经尿液排出体外。,嘌呤核苷酸的分解,尿酸,尿酸是嘌呤核苷酸在人体内分解代谢的终产物。但在鸟类，尿酸则可继续分解产生尿囊素。正常人血浆中尿酸含量约为0.120.36mmol/L(26mg%)。尿酸水溶性较差，当血浆中尿酸含量超过8mg%时，即可形成尿酸盐晶体。,痛风症患者由于体内嘌呤核苷酸分解代谢异常，可致血中尿酸水平升高，以尿酸钠晶体沉积于软骨、关节、软组织及肾，临床上表现为皮下结节，关节疼痛等。临床上常用别嘌呤醇（allopurinol）治疗痛风症。,黄嘌呤氧化酶,黄嘌呤氧化酶,别嘌呤醇,痛风症的治疗机制,别嘌呤醇的分子结构与次黄嘌呤类似，可竞争性抑制黄嘌呤氧化酶的活性，从而减少体内尿酸的生成。同时，别嘌呤与PRPP反应生成的别嘌呤核苷酸，可反馈抑制嘌呤核苷酸从头合成途径的关键酶。,3.2嘧啶核苷酸的代谢,3.2MetabolismofPyrimidineNucleotides,一、嘧啶核苷酸的合成代谢,嘧啶核苷酸从头合成途径（denovosynthesis)是指利用氨基酸、CO2等简单前体物逐步合成嘧啶核苷酸的过程。该合成过程主要在肝细胞的胞液中进行。,（一）嘧啶核苷酸的从头合成：,嘧啶合成的元素来源,尿苷酸的合成：在氨基甲酰磷酸合成酶的催化下，以Gln，CO2，ATP为原料合成氨基甲酰磷酸。,1.从头合成途径的反应过程：,两种氨基甲酰磷酸合成酶的比较,氨基甲酰磷酸在天冬氨酸转氨甲酰酶的催化下，转移一分子天冬氨酸，从而合成氨甲酰天冬氨酸，然后再经脱氢、脱羧、环化等反应，合成第一个嘧啶核苷酸，即UMP。,UMP的合成过程,胞苷酸的合成：,脱氧嘧啶核苷酸的合成：,由分解代谢产生的嘧啶/嘧啶核苷转变为嘧啶核苷酸的过程称为补救合成途径(salvagepathway)。以嘧啶核苷的补救合成途径较重要。,（二）嘧啶核苷酸的补救合成：,二、嘧啶核苷酸的分解代谢,嘧啶核苷酸可首先在核苷酸酶和核苷磷酸化酶的催化下，除去磷酸和核糖，产生的嘧啶碱可在体内进一步分解代谢。,嘧啶碱的降解过程主要在肝细胞中进行。不同类型的嘧啶碱，其分解代谢的途径和终产物不同。,（一）胞嘧啶和尿嘧啶的降解,（二）胸腺嘧啶的降解,基因信息的传递,DNA是由四种脱氧核糖核酸所组成的长链大分子，是遗传信息的携带者。生物体的遗传信息就贮存在DNA的四种脱氧核糖核酸的排列顺序中。,DNA通过复制将遗传信息由亲代传递给子代；通过转录和翻译，将遗传信息传递给蛋白质分子，从而决定生物的表现型。DNA的复制、转录和翻译过程就构成了遗传学的中心法则。,在RNA病毒中，其遗传信息贮存在RNA分子中。因此，在这些生物体中，遗传信息的流向是RNA通过复制，将遗传信息由亲代传递给子代，通过反转录将遗传信息传递给DNA，再由DNA通过转录和翻译传递给蛋白质，这种遗传信息的流向就称为反中心法则。,DNAdependentDNApolymeraseDDDPDNAdependentRNApolymeraseDDRPRNAdependentRNApolymeraseRDRPRNAdependentDNApolymeraseRDDP,DNA,复制（DDDP）,转录（DDRP）,翻译,RNA,复制（RDRP）,反转录（RDDP）,Section4DNABiosynthesis，Replication,第四节DNA的生物合成(复制）,4.1复制的基本规律,4.1BasicRulesofDNAReplication,DNA在复制时，以亲代DNA的每一股作模板，合成完全相同的两个双链子代DNA，每个子代DNA中都含有一股亲代DNA链，这种现象称为DNA的半保留复制(semi-conservativereplication)。,一、半保留复制,DNA半保留复制示意图,DNA以半保留方式进行复制，是在1958年由M.Meselson和F.Stahl所完成的实验所证明。该实验首先将大肠杆菌在含15N的培养基中培养约十五代，使其DNA中的碱基氮均转变为15N。然后将大肠杆菌移至只含14N的培养基中同步培养一代、二代、三代。分别提取DNA，作密度梯度离心，将具有不同密度的DNA分离开。,DNA半保留复制的实验证明,DNA半保留复制研究实验结果示意图,按半保留复制方式，子代DNA与亲代DNA的碱基序列一致，即子代保留了亲代的全部遗传信息，体现了遗传的保守性。遗传的保守性，是物种稳定性的分子基础，但不是绝对的。,半保留复制的意义,DNA在复制时，需在特定的位点起始，这是一些具有特定核苷酸排列顺序的片段，即复制起始点(origin)。在原核生物中，复制起始点通常为一个，而在真核生物中则为多个。,二、有一定的复制起始点,细菌和酵母菌中DNA复制起始点的碱基序列,习惯上把两个相邻DNA复制起始点之间的DNA片段定为一个复制子(replicon)。复制子是独立完成复制的功能单位。DNA复制时，局部双螺旋解开形成两条单链，这种叉状结构称为复制叉。,复制起始点与复制子示意图,复制起始点、复制子与复制叉（动画演示）,参与DNA复制的DNA聚合酶，必须以一段具有3端自由羟基（3-OH）的RNA作为引物(primer)，才能开始聚合子代DNA链。RNA引物的大小，在原核生物中通常为50100个核苷酸，而在真核生物中约为10个核苷酸。RNA引物的碱基顺序，与其模板DNA的碱基顺序相配对。,三、需要引物,DNA复制时，以复制起始点(origin)为中心，向两个方向进行解链，形成两个延伸方向相反的复制叉，称为双向复制(bidirectionalreplication)。但在低等生物中，也可进行单向复制（如滚环复制）。,四、双向复制,A.环状双链DNA及复制起始点B.复制中的两个复制叉C.复制接近终止点(termination,ter),DNA的双向复制示意图,DNA聚合酶只能以53方向聚合子代DNA链，即模板DNA链的方向必须是35。由于DNA分子中两条链的走向相反，因此当分别以两条亲代DNA链作为模板聚合子代DNA链时，子代链的聚合方向也是不同的。,五、半不连续复制,领头链(leadingstrand),随从链(laggingstrand),DNA的半不连续复制,以35方向的亲代DNA链作模板的子代链在复制时基本上是连续进行的，其子代链的聚合方向为53，这一条链被称为领头链(leadingstrand)。以53方向的亲代DNA链为模板的子代链在复制时则是不连续的，其链的聚合方向也是53，这条链被称为随从链(laggingstrand)。领头链连续复制而随从链不连续复制，就是复制的半不连续性。,由于亲代DNA双链在复制时是逐步解开的，因此，随从链的合成也是一段一段的。DNA在复制时，由随从链所形成的一些子代DNA短链称为冈崎片段(Okazakifragment)。冈崎片段的大小，在原核生物中约为10002000个核苷酸，而在真核生物中约为100个核苷酸。,2.2FactorsforDNAReplication,2.2DNA复制的条件,以四种脱氧核糖核酸(deoxynucleotidetriphosphate)为底物，即dATP，dGTP，dCTP，dTTP。,一、底物(substrate),DNA复制过程中脱氧核糖核苷酸的聚合反应,DNA复制是模板依赖性的，必须要以亲代DNA链作为模板。亲代DNA的两股链解开后，可分别作为模板进行复制。,二、模板(template),引物酶(primerase)本质上是一种依赖DNA的RNA聚合酶（DDRP），该酶以DNA为模板，聚合一段RNA短链引物(primer)，以提供自由的3-OH，使子代DNA链能够开始聚合。引物酶需组装成引发体才能催化RNA引物的合成。,三、引发体和RNA引物,在E.coli中，含有解螺旋酶(DnaB蛋白)、DnaC蛋白、引物酶(DnaG蛋白)和DNA复制起始区域的复合结构被称为引发体(primosome)。,含有解螺旋酶(DnaB蛋白)、DnaC蛋白、引物酶和DNA复制起始区域的复合结构称为引发体。,引发体的组装形成,引物酶催化合成短链RNA引物分子,引物,引物酶,四、DNA聚合酶,全称：依赖DNA的DNA聚合酶(DNA-dependentDNApolymerase,DDDP)简称：DNA-pol活性：1.53的聚合酶活性2.核酸外切酶活性,35外切酶活性,53外切酶活性,?,能切除突变的DNA片段。,能辨认错配的碱基对，并将其水解。,DNA聚合酶的核酸外切酶活性,在原核生物中，目前发现的DNA聚合酶有三种，分别命名为DNA聚合酶（pol），DNA聚合酶（pol），DNA聚合酶（pol），这三种酶都属于具有多种酶活性的多功能酶。参与DNA复制的主要是pol和pol。,（一）种类和生理功能：,pol为具有三种酶活性的单一肽链的大分子蛋白质，可被特异的蛋白酶水解为两个片段，其中的大片段保留了两种酶活性,即53聚合酶和35外切酶活性，通常被称为Klenowfragment。,Klenow片段的分子结构,pol由十种亚基组成不对称异源二聚体结构，其中亚基具有53聚合DNA的酶活性，具有复制DNA的功能；而亚基具有35外切酶的活性，与DNA复制的校正功能有关。,原核生物中的三种DNA聚合酶,在真核生物中，目前发现的DNA聚合酶有五种:,真核生物的DNA聚合酶,为了保证遗传的稳定，DNA的复制必须具有高保真性。DNA复制时的保真性主要与下列因素有关：1遵守严格的碱基配对规律；2DNA聚合酶在复制时对碱基的正确选择；3对复制过程中出现的错误及时进行校正。,（二）DNA复制的保真性(fidelity)：,DNA-pol的核酸外切酶活性和及时校读,A：DNA-pol的外切酶活性切除错配碱基；并用其聚合酶活性掺入正确配对的底物。B：碱基配对正确，DNA-pol不表现外切酶活性。,DNA连接酶(DNAligase)可催化两段DNA片段之间磷酸二酯键的形成，从而把两段相邻的DNA链连接成一条完整的链。,五、DNA连接酶,DNA连接酶的连接作用,DNA连接酶催化的条件是：需一段DNA片段具有3-OH，而另一段DNA片段具有5-Pi基；未封闭的缺口位于双链DNA中，即其中有一条链是完整的；需要消耗能量，在原核生物中由NAD+供能，在真核生物中由ATP供能。,DNA连接酶在复制中起最后接合缺口的作用。在DNA修复、重组及剪接中也起缝合缺口作用。是基因工程的重要工具酶之一。,DNA连接酶的作用,解螺旋酶(helicase)，又称解链酶或rep蛋白，是用于解开DNA双链的酶蛋白。每解开一对碱基，需消耗2分子ATP。,六、解螺旋酶,单链DNA结合蛋白（singlestrandbindingprotein,SSB），又称螺旋反稳蛋白(HDP)，是一些能够与单链DNA结合的蛋白质因子。,七、单链DNA结合蛋白,SSB的生理作用,使解开双螺旋后的DNA单链能够稳定存在，即稳定单链DNA，便于其作为模板复制子代DNA；保护单链DNA，避免核酸酶的降解。,八、DNA拓扑异构酶,人类拓扑异构酶的分子结构,能够松解DNA超螺旋结构的酶。,DNA复制过程中正超螺旋的形成,解链过程中正超螺旋的形成,拓扑异构酶的作用特点既能水解、又能连接磷酸二酯键,拓扑异构酶拓扑异构酶,分类,DNA拓扑异构酶的作用机制,3.3DNA生物合成过程,3.3TheProcessofDNABiosynthesis,DNA复制的起始阶段，由下列两步构成。1解旋解链，形成复制叉：由拓扑异构酶和解链酶作用，使DNA的超螺旋及双螺旋结构解开，碱基间氢键断裂，形成两条单链DNA。单链DNA结合蛋白（SSB）四聚体结合在两条单链DNA上，形成复制叉。,一、复制的起始,2引发体组装和引物合成：由解螺旋酶(DnaB蛋白)、DnaC蛋白、引物酶(DnaG蛋白)和DNA复制起始区域形成引发体；在引物酶的催化下，以DNA为模板，合成一段短的RNA片段，从而获得3端自由羟基（3-OH）。,二、复制的延长,复制的延长指在DNA聚合酶催化下，以35方向的亲代DNA链为模板，从53方向聚合子代DNA链。其化学本质是dNTP以dNMP的方式逐个加入引物或延长中的子链上，磷酸二酯键不断生成。在原核生物中，参与DNA复制延长的是DNA聚合酶；而在真核生物中是DNA聚合酶。,dATP,dGTP,dTTP,dCTP,dTTP,dGTP,dATP,dCTP,OH3,3,DNA复制的延长过程,DNA复制过程简图,三、复制的终止,在复制过程中形成的RNA引物，需由RNA酶来水解去除；RNA引物水解后遗留的缺口，由DNA聚合酶（原核生物）或DNA聚合酶（真核生物）催化延长缺口处的DNA，直到剩下最后一个磷酸酯键的缺口。,（一）去除引物，填补缺口：,在DNA连接酶的催化下，生成最后一个磷酸酯键，将冈崎片段连接起来，形成完整的DNA长链。,（二）连接冈崎片段：,随从链上不连续性片段的连接,DNA复制的过程,4.4DNA的损伤（突变）与修复,4.4DNADamage（Mutation）andRepair,由自发的或环境的因素引起DNA一级结构的任何异常的改变称为DNA的损伤，也称为突变（mutation）。常见的DNA的损伤包括碱基脱落、碱基修饰、交联，链的断裂，重组等。,一、突变的意义,（一）突变是进化、分化的分子基础（二）突变导致基因型改变（三）突变导致死亡（四）突变是某些疾病的发病基础,（一）自发因素：1.自发脱碱基：由于N-糖苷键的自发断裂，引起嘌呤或嘧啶碱基的脱落。每日可达近万个核苷酸残基。2.自发脱氨基：胞嘧啶自发脱氨基可生成尿嘧啶，腺嘌呤自发脱氨基可生成次黄嘌呤。每日可达几十到几百个核苷酸残基。3.复制错配：由于复制时碱基配对错误引起的损伤，发生频率较低。,二、引起突变的因素,由紫外线、电离辐射、X射线等引起的DNA损伤。其中，X射线和电离辐射常常引起DNA链的断裂，而紫外线常常引起嘧啶二聚体的形成，如TT，TC，CC等二聚体。这些嘧啶二聚体由于形成了共价键连接的环丁烷结构，因而会引起复制障碍。,（二）物理因素：,嘧啶二聚体的形成,1.脱氨剂：如亚硝酸与亚硝酸盐，可加速C脱氨基生成U，A脱氨基生成H。,（三）化学因素：,2.烷基化剂：这是一类带有活性烷基的化合物，可提供甲基或其他烷基，引起碱基或磷酸基的烷基化，甚至可引起邻近碱基的交联。3.DNA加合剂：如苯并芘，在体内代谢后生成四羟苯并芘，与嘌呤共价结合引起损伤。4.碱基类似物：如5-FU等，可掺入到DNA分子中引起损伤或突变。5.断链剂：如过氧化物，含巯基化合物等，可引起DNA链的断裂。,三、突变的分子改变类型,DNA分子上单一碱基的改变称点突变(pointmutation)。,镰形红细胞贫血病人Hb(HbS)亚基,正常成人Hb(HbA)亚基,血红蛋白-亚基的点突变,3.缺失：一个碱基或一段核苷酸链从DNA大分子上消失。,4.插入：原来没有的一个碱基或一段核苷酸链插入到DNA大分子中间。,框移突变是指三联体密码的阅读方式改变，造成蛋白质氨基酸排列顺序发生改变。,缺失或插入都可导致框移突变(移码突变）。,缺失引起的框移突变,5.重排DNA分子内较大片段的交换，称为重组或重排。,由基因重排引起的两种地中海贫血基因型,四、DNA损伤的修复,DNA损伤修复(repair)：是对已发生分子改变的补偿措施，使其尽可能回复为原有的天然状态。,光修复(lightrepair)切除修复(excisionrepair)重组修复(recombinationrepair)SOS修复,修复的主要类型：,这是一种广泛存在的修复作用，能够修复任何嘧啶二聚体的损伤。修复过程由光修复酶(photolyase)催化完成。,（一）光修复（lightrepair）：,光修复酶的分子结构,其修复过程为：光修复酶(photolyase)识别嘧啶二聚体并与之结合形成复合物。在300600nm可见光照射下，酶获得能量，将嘧啶二聚体的丁酰环打开。光修复酶从DNA上解离。,这也是一种广泛存在的修复机制，可适用于多种DNA损伤的修复。切除修复机制的基本过程是将受损的DNA片段切除，然后再以对侧链为模板，重新合成新链进行修复。,（二）切除修复(excisionrepair)：,在原核生物中，与DNA切除修复有关的蛋白质包括UvrA、UvrB、UvrC，以及DNApol和DNA连接酶。UvrA和UvrB主要起辨认和结合受损部位的作用；而UvrC则主要与受损片段的切除有关。,原核生物DNA切除修复的机制,真核生物XP切除修复系统,1.识别,3.切除,4.修复,2.组装,这是DNA的复制过程中所采用的一种有差错的修复方式。修复时，利用重组蛋白RecA的核酸酶活性，将另一股健康亲链与损伤缺口相互交换。,（三）重组修复(recombinationrepair)：,RecA的分子结构,RecA重组蛋白修复DNA示意图,当DNA损伤广泛难以继续复制时，由此而诱发出一系列复杂的反应。在E.coli中，各种与修复有关的基因，组成一个称为调节子(regulon)的网络式调控系统。这种修复特异性低，对碱基的识别、选择能力差。通过SOS修复，复制如能继续，细胞是可存活的。然而DNA保留的错误较多，导致较广泛、长期的突变。,（四）SOS修复（SOSRepair）：,第五节RNA的生物合成(转录),Section5RNABiosynthesis,Transcription,在RNA聚合酶的催化下，以一段DNA链为模板合成RNA，从而将DNA所携带的遗传信息传递给RNA的过程称为转录（transcription）。经转录生成的RNA有多种，主要的是rRNA，tRNA，mRNA，snRNA和HnRNA等。,复制和转录的区别,5.1RNA转录合成的特点,5.1CharactersofRNABiosynthesis,转录（transcription）的不对称性就是指以双链DNA中的一条链作为模板进行转录，从而将遗传信息由DNA传递给RNA。对于不同的基因来说，其转录信息可以存在于两条不同的DNA链上。,一、转录的不对称性,能够转录RNA的那条DNA链称为模板链(templatestrand)，也称作有意义链或Watson链。与模板链互补的另一条DNA链称为编码链(codingstrand)，也称为反义链或Crick链。,模板链,编码链,编码链,模板链,模板链和编码链的相对性,模板链、编码链与转录及翻译的关系,RNA转录合成时，以DNA作为模板，在RNA聚合酶的催化下，连续合成一段RNA链，各条RNA链之间无需再进行连接。,二、转录的连续性,RNA转录合成时，只能向一个方向进行聚合，所依赖的模板D