DNA的复制与重组课程

,DNA的复制与重组,一，DNA的复制,*,WastonandCrick,1953,现代生物化学和分子生物学的一个最基本的观点在生命有机体中，基因是唯一能够复制，并且能永远存在的单位，而其意义最终须通过蛋白质才体现出来。从DNA到蛋白质，遗传信息的流动遵循着中心法则。,1中心法则,2DNA的半保留复制,半保留复制（semiconservativereplication）即新的双链DNA中，一股链来自模板，一股链为新合成的。,半保留复制的意义复制的这种方式可保证亲代的遗传特征完整无误的传递给子代，体现了遗传的保守性。,半保留复制实验依据1958年M.Messelson等用实验予以了证实双螺旋结构是半保留复制的分子基础,3DNA的半不连续复制,前导链（leadingstrain）:为连续合成，合成方向与解链方向一致，它的模板DNA链是53链。随从链（laggingstrain）：不连续合成，在RNA引物基础上分段合成DNA小片段（冈崎片段），方向与解链方向相反，它的模板DNA是35链。,（以原核生物大肠杆菌为例）1.原料：dNTP，Mg+2.双链DNA模板3.引物（primer），小片段的DNA或RNA，常是RNA，有游离的3OH。4.引物酶（primase，DnaG），用于合成复制所必需的RNA引物5.解螺旋酶(helicase),DnaB,由DnaA和DnaC协助在复制的起始点（OriC）上解开双螺旋。,4DNA的复制过程,4.1与复制有关的酶和因子,单链结合蛋白（SSB，singlestrandedbindingprotein）稳定已经解开成两股的DNA单链，防止其退火复性。7.拓扑异构酶(DNAtopoisomerase)DNA分子中存在打结，缠绕、连环的超螺旋现象。I型酶：切开双链中的一股，使DNA不致打结，切口的3端可通过自由转动一周再与5端磷酸连接，不需ATP。II型酶：切断处于超螺旋状态中双股链中的某个部位，通过切口使超螺旋松弛，利用ATP使DNA恢复复制所要求的负超螺旋状态。(注:拓扑一词的含义是指物体或图象作弹性移位而又保持物体不变的性质。),8.DNA聚合酶（DNApolymerase）,聚合酶III主要的复制酶，兼有校读、纠错的功能有从53延伸多核苷酸链的聚合酶活性，有模板依赖性，其延伸的方式是依据碱基互补配对的原则，将原料dNTP与末端核苷酸游离的3OH以3,5磷酸二酯键连接，同时释出一个PPi。DNA聚合酶延伸多核苷酸链的方向总是53有从35外切酶的活性，以切除可能错配的核苷酸,聚合酶I用于切除引物RNA,并填补留下的空隙有从53延伸多核苷酸链的聚合酶的活性；有从35外切酶的活性，以切除可能错配的核苷酸；有从53外切酶的活性，其作用是切除引物聚合酶II活性弱,作用与聚合酶III相似有从53延伸多核苷酸链的聚合酶活性；有从35外切酶的活性,真核的DNA聚合酶真核DNA的复制至少涉及5种复制酶、和，其中、参与染色体DNA的复制。有引物要求；负责DNA的修复；的功能是线粒体DNA的复制。,9.DNA连接酶（ligase）,将不连续的DNA片段以3，5磷酸二酯键连接起来，原核生物通过分解NAD为NMN和Pi提供能量，真核生物则消耗ATP,5原核生物DNA的复制,In1963,JohnCairnsTechnique:GrewE.coliin3HthymidineWaitedtillcellswereinthemiddleofreplicationLysedthecellsveryverygentlySpreadthelysateonanEMgridExposedthegridtoX-rayfilmforTWOmonths.,ReplicationoftheE.colichromosome,WhatCairnsexperiment(1963)showed:,E.colihasacircularchromosome.E.colihasasingleoriginofreplication.InE.coli,replicationandunwindingaresimultaneous.,大肠杆菌(E.coli)的OriC复制原点,大肠杆菌基因组的复制原点位于天冬酰胺合酶和ATP合酶操纵子之间，全长245bp,称为oriC。,复制的起始,大肠杆菌DNA复制的步骤,复制的延伸,复制的终止,6真核生物DNA的复制,真核生物DNA的复制特点,有多处复制起始点；在全部完成复制之前，各个起始点上DNA的复制不能再开始；DNA复制只在S期进行。复制子相对较小，为40-100千碱基对。,真核生物DNA的复制子被称为ARS(autonomouslyreplicatingsequences)，长约150bp左右，包括数个复制起始必需的保守区。,真核生物DNA复制的起始需要起始点识别复合物（originrecognitioncomplex，ORC）参与，ORC结合于ARS，它是由6种蛋白质组成的启动复合物。,真核生物DNA复制叉的移动速度大约只有50bp/秒。因此，人类DNA中每隔30,000-300,000bp就有一个复制起始位点。,已发现的真核生物DNA聚合酶有15种以上。在哺乳动物细胞中主要有5种DNA聚合酶，分别称为DNA聚合酶、和。,真核生物DNA聚合酶的特性比较,DNA聚合酶主要参与引物合成。,DNA聚合酶活性水平稳定，主要在DNA损伤的修复中起作用。,DNA聚合酶主要负责DNA的复制。,DNA聚合酶与后随链合成有关，在DNA合成过程中核苷切除以及碱基的切除修复中起着重要的作用。,DNA聚合酶在线粒体DNA的复制中发挥作用。,RF-Cisafive-subunitcomplexAllsubunitsarerelatedinsequenceandhaveATPbindingmotifsATPhydrolysisbyRF-CisassociatedwiththeloadingofPCNARF-Cisthefunctionalhomologoftheclamp-loadergcomplex,Polymeraseswitchingoccursevenonlaggingstrands;polddoesmostofDNAsynthesis,二，DNA的重组,第一节概述,一、DNA重组（recombination）1、概念：DNA分子内或分子间发生遗传信息的重新组合，称为遗传重组（geneticrecombination）,或者基因重排(generearrangement)。2、意义：重组是遗传学的灵魂，没有重组就没有生物的进化；没有重组也就没有现代的分子克隆技术,二、DNA重组的类型1、同源重组（HomologousRecombination）2、位点特异性重组（Site-specificRecombination）3、DNA的转座（transposition）,第二节同源重组,一、概述1、定义：两个DNA分子同源序列之间进行的重组2、条件：（1）两个DNA分子有同源序列（相关的酶可以用任何一对同源序列为底物）（2）两个DNA分子必须紧密接触3、发生：真核生物:非姐妹染色单体交换相对应的区域。原核生物:依赖recA蛋白，并形成Holliday结构Holiday模型（1964年）,二、大肠杆菌同源重组的分子基础（一）RecA1、作用：可促进单链同化或单链吸收RecA具有使DNA单链置换双链中同源链的能力,特异地识别单链DNA，并能将之与同源DNA中的互补顺序“退火”，同时将另一条链排挤出去（取代），形成杂种分子2、单链同化发生的三个条件（1）其中一个DNA必须存在单链区（2）其中一个DNA必须有一个自由3末端（3）此单链区和3末端必须位于两分子之间互补的区域内,（二）RecBCD复合体1、酶的活性：（1）核酸外切酶（2）核酸内切酶（3）解旋酶2、作用：在Chi位点处产生含3游离未端单链.,（三）Chi位点-RecBCD识别的靶位点5GCTGGTGG33CGACCACC5是重组频率较高的部位E.coli中每隔约510kb有一个拷贝，,断裂和重连产生异源双链DNA1.同源序列排列在一起；2.酶切。通过核酸酶和RecBCD蛋白复合体的作用在一对同源DNA上产生切口；3.入侵。含有3端切口的ssDNA被recA蛋白包裹形成recA蛋白-ssDNA细丝；RecA-ssDNA细丝寻找相对的DNA双螺旋上的相应序列。,三、Holiday重组模型,4.游离端交叉连接，形成Holliday结构5.通过分支迁移产生异源双链DNA。,十字形结构,6.空间重排。十字型两臂旋转180度7.解离(两种不同方式)8.修补连接,附：基因敲除(Geneknockout),是80年代后半期应用DNA同源重组原理发展起来的一门新技术是指对一个结构已知但功能未知的基因，从分子水平上设计实验，将该基因去除，或用其它顺序相近基因取代，然后从整体观察实验动物，推测相应基因的功能。,基因敲除的技术路线如下：（1）构建重组基因载体（2）用电穿孔、显微注射等方法把重组DNA转入受体细胞核内,基因敲除的靶细胞目前最常用的是小鼠ES细胞（3）用选择培养基筛选已击中的细胞（4）转入假孕母鼠使其生长成为转基因动物，对转基因动物进行形态观察及分子生物学检测。,四细菌的基因转移与重组,3种形式：1）转化2）转导3）接合,1转化（transformation）,定义：细菌品系由于吸收了外源DNA（转化因子）而发生遗传性状的改变现象。,转化子（transformant）：经转化后出现了供体性状的受体细胞称为转化子，即转化成功的菌落。,目前已知有二十多个种的G+和G-细菌具有自然转化的能力此过程可以发生在土壤和海洋环境中，可能是自然界遗传交换的重要方式。,（1）转化因子本质是离体的DNA片断或质粒DNA。转化因子进入细胞前还会被酶解成更小的片段，约8kb。在不同的微生物中，转化因子的形式不同，dsDNA,ssDNA.但不管何种情况，最易与细胞表面结合的仍是dsDNA。由于每个细胞表面能与转化因子相结合的位点有限（如肺炎链球菌约10个），因此，从外界加入无关的dsDNA就可竞争并干扰转化作用。质粒DNA也是良好的转化因子，但它们通常并不能与核染色体组发生重组。转化的频率通常为0.11，最高为20。,（2）人工转化,用CaCl2处理细胞，PEG介导、电穿孔、基因枪法等是常用的人工转化手段（使细胞膜更易于透过DNA）。,在自然转化的基础上发展和建立的一项细菌基因重组手段，是基因工程的奠基石和基础技术。,用多种不同的技术处理受体细胞，使其人为地处于一种可以摄取外源DNA的“人工感受态”。,质粒的转化效率高（不像线型DNA那样易于降解，而且还能在宿主中复制。任何来源的DNA将其连接到质粒上都能进入受体细胞）.,定义：噬菌体DNA被感受态细胞摄取并产生有活性的病毒颗粒。,（3）转染(transfection)：,现在把DNA转移至动物细胞的过程也称转染,提纯的噬菌体DNA以转化的（而非感染）途径进入微生物细胞并表达后产生完整的病毒颗粒。,特点：,2转导（transduction）,转导：利用完全或部分缺陷噬菌体为媒介，把供体细胞的小片段DNA携带到受体细胞中，通过交换与整合，使后者获得前者部分遗传性状的现象。,由转导作用而获得供体细胞部分遗传性状的重组受体细胞称为转导子（transductant）携带供体部分遗传物质（DNA片段）的噬菌体称为转导噬菌体。,细菌转导的二种类型：,普遍性转导,局限性转导,（1）、普遍性转导（generalizedtransduction）,通过极少数完全缺陷噬菌体对供体菌基因组上任何小片段DNA进行误包，而将其遗传性状传递给受体菌的现象，称普遍性转导。,转导模型,（2）.局限转导（restrictedtransduction）定义：通过部分缺陷的温和噬菌体把供体菌的少数特定基因携带到受体菌中，并与后者的基因组整合、重组，形成转导子的现象。媒介：部分缺陷噬菌体（丢失自身一部分基因，并被同等长度的宿主基因所取代）只能转导个别特定基因,大肠杆菌中噬菌体的正常裂解及半乳糖基因转导噬菌体的形成过程,3、接合(conjugation),通过细胞与细胞的直接接触而产生的遗传信息的转移和重组过程,（1）.接合现象的发现和证实,1946年，JoshuaLederberg和EdwardL.Tatum细菌的多重营养缺陷型杂交实验,中间平板上长出的原养型菌落是两菌株之间发生了遗传交换和重组所致！,为了减少所培养的结果是回复突变的机会，采用了双重或三重营养缺陷型。该实验是建立在不大可能同时发生两种或三种回复突变的设想上的。,证实接合过程需要细胞间的直接接触的“U”型管实验（BernardDavis，1950）,大肠杆菌的接合型与接合,F菌株,第三节位点特异性重组,一、定义：不依赖于DNA顺序的同源性，而依赖于能与某些酶相结合的特异的DNA序列的存在。二、噬菌体对E.coliDNA的整合（一）DNA存在两种形式裂解状态溶源状态（二）通过位点特异性重组实现两种类型间的转换DNA整合到宿主DNA进入溶源状态DNA从宿主DNA中切离进入裂解状态,（三）催化重组的酶1、整合酶Int(integrase)：有拓扑异构酶活性2、整合宿主因子（IHF，integrationhostfactor）3、切除酶（excisionase）/终止重组（四）重组位点：附着位点（attachmentsite）attP（POP）和attB（BOB）有15bp核心序列配对（五）重组过程：1、整合：POP+BOBBOPPOB2、切离：BOPPOBPOP+BOB,attP,attB,attP,attB,第四节DNA的转座,一、转座子（transposon）的定义：存在于染色体DNA上可自主转移座位的基本单位二、转座子发现：McClintockB：1938年，提出转座基因概念1983年，获诺贝尔生理医学