用多聚酶链式反应扩增DNA片断PPT课件

一、基础知识,（一）、PCR技术的概念是一种体外迅速扩增DNA片段的技术，它能以极少量的DNA为模板，在几小时内复制出上百份的DNA拷贝（二）、PCR技术的应用遗传疾病的诊断、刑侦破案、古生物学、基因克隆和DNA序列测定,-,2,1细胞内DNA复制条件分析：,-,3,DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，只能从3端延伸DNA链。因此，DNA复制需要引物。,-,4,2、DNA合成的方向,（1）DNA单链两端的命名,基本单位脱氧核苷酸,1号碳,5号碳,3号碳,-,5,-,6,一个核苷酸上的磷酸基团上的“OH”和另一个核苷酸分子的第三位碳原子上的羟基之间失去一分子水，形成3,5-磷酸二酯键。数量庞大的四种脱氧核苷酸通过3,5-磷酸二酯键彼此连接起来形成脱氧核苷酸链。通常将DNA的羟基“OH”末端称为3端，而磷酸基团的末端称为5端,-,7,一个核苷酸上的磷酸基团上的“OH”和另一个核苷酸分子的第三位碳原子上的羟基之间失去一分子水，形成3,5-磷酸二酯键。数量庞大的四种脱氧核苷酸通过3,5-磷酸二酯键彼此连接起来形成脱氧核苷酸链。通常将DNA的羟基“OH”末端称为3端，而磷酸基团的末端称为5端,-,8,3端,3端,5端,5端,一个核苷酸上的磷酸基团上的“OH”和另一个核苷酸分子的第三位碳原子上的羟基之间失去一分子水，形成3,5-磷酸二酯键。数量庞大的四种脱氧核苷酸通过3,5-磷酸二酯键彼此连接起来形成脱氧核苷酸链。通常将DNA的羟基“OH”末端称为3端，而磷酸基团的末端称为5端,-,9,DNA的反向平行结构：1通过3,5-磷酸二酯键连接形成核苷酸长链：2、DNA分子两条反向平行的脱氧核苷酸链根据碱基互补配对原则形成氢键连接而成。,3端,3端,5端,5端,-,10,DNA的反向平行结构：1通过3,5-磷酸二酯键连接形成核苷酸长链：2、DNA分子两条反向平行的脱氧核苷酸链根据碱基互补配对原则形成氢键连接而成。,-,11,引物：一小段单链DNA或RNA，一般2030个碱基，能与DNA母链的一段碱基序列互补配对。,-,12,后续加工：DNA聚合酶I将引物切去，并合成空缺处的DNA单链，再由DNA连接酶将不连续的DNA子链连接起来DNA聚合酶不但能够催化磷酸二酯键的形成，还具有校对功能。它在每引入一个核苷酸后都要复查一次，只有碱基配对无误后才能继续往下聚合。思考DNA分子能准确复制的原因有哪些？DNA双螺旋结构提供模板；碱基互补配对；DNA聚合酶的复查功能。,-,13,DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，只能从3端延伸DNA链。DNA合成的方向从子链由5端向3端延伸,-,14,DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，只能从3端延伸DNA链。DNA合成的方向从子链由5端向3端延伸,-,15,3、DNA复制的前提是_用_方法,思考：DAN复制的前提是什么？体外扩增DNA如何打开双链？,双链的解开,控制温度,-,16,DNA双链,单链,变性（加热80-100）,复性（缓慢冷却）,4、DNA分子的热变性原理：,变性的目的：,复性的目的：,解开双链,有利于引物和引物与两条单链的结合,-,17,PCR的反应过程-DNA分子的热变性原理,变性：在95时DNA解旋复性：在55时引物与DNA单链结合延伸：在72时合成DNA子链（两个引物间的序列）,思考：高温使DNA解旋，但普通DNA聚合酶会失活,_找到耐高温DNA聚合酶,P21托马斯.布鲁克,5、体外DNA复制的条件(PCR反应的条件),DNA模板；分别与两条模板链相结合的两种引物；四种脱氧核苷酸；耐高温的聚合酶；控制温度，但不需解旋酶.,二、PCR的反应过程,以便增加大分子模板DNA彻底变性的概率,1、循环之前的一次预变性,2、PCR一般要经历三十多次循环,（1）变性：当温度上升到90以上时，双链DNA解聚为单链。（2）复性：温度下降到50左右，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。（3）延伸：温度上升到72左右，溶液中的四种脱氧核苷酸(A，T，C，G)在DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。,二、PCR的反应过程,3、每个循环包括：变性复性延伸,（1）PCR循环-变性,95变性,（1）PCR循环-变性,95变性,（1）PCR循环-变性,95变性,（2）PCR循环复性,55复性,（3）PCR循环延伸,（3）PCR循环延伸,（3）PCR循环延伸,（3）PCR循环延伸,-,29,-,30,引物和引物不同,-,32,4、循环特点：,上一次循环的产物为下一循环的模板结果单链中最初母链有两条其它子代DNA分子都为双引物分子处于两引物之间的DNA序列呈指数增长2N,二、实验步骤：,准备好PCR反应体系的配方P62,用微量移液器按配方在微量试管中加入各组分,盖严盖子，用手指轻轻弹击管壁,离心10分钟,将离心管放入PCR仪上，设置好循环程序,电泳检测PCR结果,三、操作提示：,操作提示1为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头、缓冲液以及蒸馏水等在使用前必须进行高压蒸汽灭菌。2PCR所用的缓冲液和酶应分装成小份，并在-20储存。使用前，将所需试剂从冰箱拿出，放在冰块上缓慢融化。3在微量离心管中添加反应成分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换。所有的成分都加入后，盖严离心管口的盖子，用手指轻轻弹击管的侧壁，使反应液混合均匀，再将微量离心管放在离心机上，离心约10s，使反应液集中在离心管底部，再放入PCR仪中进行反应。,目的：,避免外源性DNA大量扩增造成假阳性反应。,录像,-,35,实验操作步骤：（1）按配方将所需试剂摆放在实验桌上（准备）（2）用微量移液器按配方在微量离心管中依次加入各组分（移液）（3）盖严离心管口的盖子，用手指轻轻弹击管壁（混合）（4）将微量离心管放在离心机上（离心）（5）将离心管放入PCR仪上，设置好PCR仪的循环程序（反应）,四、结果分析与评价,1、原理：DNA在260nm的紫外线波段有一强烈的吸收峰(图5-11)。可以利用DNA的这一特点进行DNA含量的测定。,四、结果分析与评价(了解),2、具体方法如下。1）将样品进行50倍稀释：取2LPCR反应液，加入98L蒸馏水。2）以蒸馏水作为空白对照，在波长260nm处，将紫外分光光度计(图5-12)的读数调节至零。3）加入步骤1中的DNA稀释液100L至比色杯中，测定260nm处的光吸收值。4）根据下面的公式计算DNA含量。DNA含量(g/ml)=50 x(260nm的读数)x稀释倍数,-,38,理论上DNA扩增数目的计算,1、一条DNA，复制n次，DNA为2n,2、a条DNA，复制n次，DNA为a2n,PCR优点：,原理虽然复杂，但操作却十分简单。快速、高效、灵活和易于操作,复习：PCR技术与体内DNA复制的区别：,1.PC