yong-基因工程基本操作程序分析.ppt

1.2基因工程的基本操作程序,【目标导航】1.结合课本图16，整体把握并说出基因工程的基本操作程序。2.理解获取目的基因的途径及基因表达载体的模式结构。3.理解目的基因导入受体细胞的方法、检测与鉴定目的基因的方法。,1、目的基因的获取,2、基因表达载体的构建,3、将目的基因导入受体细胞,4、目的基因的检测与鉴定,基因工程基本操作的四个步骤,一、目的基因的获取,(一)、目的基因主要是_,编码蛋白质的基因,（二）、获取目的基因的常用方法有哪些?,1、从基因文库中获取,2、利用PCR技术扩增,3、人工合成,阅读教材P8-11,如：与生物抗性相关的基因、与优良品质相关的基因、与生物药物和保健品相关的基因、与毒物降解相关的基因、与工业用酶相关的基因、具调控作用的因子等。,补：原核细胞的基因结构,编码区下游,非编码区,非编码区,编码区,编码区上游,启动子,终止子,补：真核细胞的基因结构,内含子,外显子,原核细胞的基因结构,非编码区,非编码区,编码区,编码区上游,编码区下游,与RNA聚合酶结合位点,启动子,终止子,不编码蛋白质。,：编码蛋白质,连续不间断,编码区,非编码区,原核细胞的基因结构,调控遗传信息表达,上游的RNA聚合酶结合位点:,启动子,真核细胞的基因结构,编码区,非编码区,非编码区,内含子,外显子,启动子,终止子,编码区上游,编码区下游,真核细胞的基因结构,编码区,非编码区,外显子：能编码蛋白质的序列内含子：不能编码蛋白质的序列,：有调控作用,上游有RNA聚合酶结合位点(启动子)。,非编码序列：,包括非编码区和内含子,非编码序列：,包括非编码区和内含子,与RNA聚合酶结合位点,结构基因,外显子,内含子,转录、加工修饰,mRNA,能够编码蛋白质的序列叫做外显子,不能够编码蛋白质的序列叫做内含子,内含子：,外显子：,原核细胞与真核细胞的基因结构比较,连续,不连续,编码区,非编码,转录,翻译,转录,翻译,1下列关于基因结构的认识中，正确的是（）A大豆基因中内含子是能够编码蛋白质的序列B乳酸菌与酵母菌基因结构中都存在外显子和内含子C大肠杆菌基因与RNA聚合酶结合位点位于编码区的下游D水稻细胞基因的编码区中存在非编码序列2（多选）原核细胞与真核细胞基因结构的共同特点是（）A编码区都有能编码蛋白质的序列B编码区都是连续的C非编码区都能调控遗传信息的表达D非编码区都有RNA聚合酶结合的位点,D,ACD,1、从基因文库中获取目的基因,（1）.基因文库,将含有某种生物不同基因的许多DNA片断，导入到受体菌的群体中，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库。,种类,基因组文库：含有一种生物的全部基因,部分基因文库：只包含了一种生物的部分基因，如：cDNA文库,基因文库中不是直接保管相应基因，而是保存受体菌，菌中含基因。,（1）基因组文库的构建,提取某生物全部DNA,用适当限制酶切割,许多DNA片段,与载体连接导入受体菌群,该生物基因组文库,（每个受体菌含有一段不同的DNA片段）,（2）cDNA文库的构建mRNA反转录形成,mRNA（某一发育时期）,逆转录酶,杂交双链,核酸酶H,单链DNA,DNA聚合酶,双链DNA(cDNA),与载体连接导入受体菌群,该生物cDNA文库,（2）.基因文库的构建方法,真核生物的基因用逆转录法得到的cDNA与原基因相同吗？有哪些差异？原核生物基因呢？,思考？,编码区,非编码区,非编码区,DNA聚合酶,剪接有关的酶,RNA聚合酶,mRNA前体,mRNA,单链DNA,cDNA,逆转录酶,转录,剪接,逆转录,复制,启动子,终止子,基因,不含非编码系列。即不含非编码区和内含子,（3）构建基因文库的目的？,怎样从基因文库中得到我们所需的目的基因呢?,依据：目的基因的有关信息。如：根据基因的核苷酸序列基因的功能基因在染色体上的位置基因的转录产物mRNA基因翻译产物蛋白质等特性,（4）从基因文库中得到目的基因的方法,直接分离法(鸟枪法),基因组文库和部分基因文库的比较,小,大,无,有,无,有,某种生物的部分基因,某种生物的全部基因,可以,部分基因可以,构建基因组DNA文库时，首先应分离细胞的A、染色体DNAB、线粒体DNAC、总mRNAD、tRNA,目的基因可从基因文库中获得，下列有关基因文库的描述正确的是A、某生物的全套基因就是一个基因文库B、将含有某种生物不同的许多DNA片段，导入某个生物体内，则这个生物就是一个基因文库C、含有一种生物所有基因的基因文库叫做基因组文库D、含有一种生物的一部分基因的基因文库叫cDNA文库,A,C,2、利用PCR技术扩增目的基因,概念：PCR全称为_，是一项在生物_复制_的核酸合成技术。,原理：_,多聚酶链式反应,体外,特定DNA片段,DNA复制,5,3,DNA复制的条件：模板DNA、脱氧核苷酸、解旋酶、引物酶、DNA聚合酶、DNA连接酶,PCR技术,原理：前提：原料：优点过程：,PCR扩增仪,DNA复制,已知目的基因的一段核苷酸序列,：以_方式扩增，在短时间内大量扩增目的基因,指数,模板DNA；DNA引物；四种脱氧核苷酸；热稳定DNA聚合酶（Taq酶）；离子,变性,复性,延伸,过程：,a、DNA变性（90-95）：双链DNA模板在热作用下，_断裂，形成_,b、退火（复性55-65）：系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部_。,c、延伸（70-75）：在Taq酶的作用下，合成与模板互补的_。,氢键,单链DNA,双链,DNA链,d.重复a.b.c步骤：每重复一次，目的基因增加_倍,一,过程：,PCR反应体系中目的基因成指数(2n)形式扩增,方式：以_方式扩增，即_（n为扩增循环的次数）,条件：_、_、_、_、前提条件:_,结果：,模板DNA(含目的基因),四种脱氧核苷酸,一对引物,热稳定DNA聚合酶,指数,2n,使_在短时间内成百万倍地扩增,已知基因的核苷酸序列,含目的基因的DNA片段,PCR技术扩增与DNA复制的比较,碱基互补配对原则,碱基互补配对原则,四种脱氧核苷酸、模板、酶、ATP,四种脱氧核苷酸、模板、酶、引物,DNA在高温下变性解旋,解旋酶催化解旋,半保留复制、边解旋变复制,半保留复制、全解旋再复制,体外复制,主要在细胞核内,大量的DNA片段,形成整个DNA分子,热稳定的DNA聚合酶,细胞内的DNA聚合酶、解旋酶、DNA连接酶等,蛋白质的氨基酸序列,mRNA的核苷酸序列,基因的核苷酸序列,目的基因,化学合成,推测,推测,3、人工合成法：,在基因较小，核苷酸序列已知的情况下，可以利用DNA合成仪人工合成,化学法合成的目的基因含内含子、启动子和终止子吗？,一、目的基因的获取,1、从基因文库中获取,2、利用PCR技术扩增,3、人工合成,种类,基因组文库：含有一种生物的全部基因,部分基因文库：只包含了一种生物的部分基因，如：cDNA文库,课堂小结：,2、下列属于获取目的基因的方法的是()利用mRNA反转录形成从基因组文库中提取从受体细胞中提取利用PCR技术利用DNA转录人工合成A.B.C.D.,1在已知基因的核苷酸序列的情况下，获取目的基因的最方便方法是A、化学合成法B、基因组文库法C、CDNA文库法D、聚合酶链反应,3、在基因工程中，把选出的一个目的基因（共1000个脱氧核苷酸对，其中腺嘌岭脱氧核苷酸是460个）放入DNA扩增仪中扩增4次，那么，在扩增仪中应放入胞嘧啶脱氧核苷酸的个数是（）个,A.540B.8100C.17280D.7560,在遗传工程中，若有一个控制有利性状的DNA分子片段为ATGTGTACAC，要使其数量增多，可用PCR技术进行人工复制，复制时应给予的条件是双链DNA分子为模板ATGTG或TACAC模板链四种脱氧核苷酸四种核苷酸DNA聚合酶热稳定DNA聚合酶引物温度变化恒温ABCD,D,在基因工程中，把选出的目的基因（共1000个脱氧核苷酸对，其中腺嘌岭脱氧核苷酸是460个）放入DNA扩增仪中扩增4代，那么，在扩增仪中应放入胞嘧啶脱氧核苷酸的个数是A.540个B.8100个C.17280个D.7560个,B,在已知序列信息的情况下，获取目的基因的最方便方法是A、化学合成法B、基因组文库法C、cDNA文库法D、聚合酶链反应,下列获取目的基因的方法中需要模板链的是从基因文库中获取目的基因利用PCR技术扩增目的基因反转录法通过DNA合成仪利用化学方法人工合成ABCD,A,D,（1）用一定的_切割质粒，使其出现一个切口，露出_。（2）用_切断目的基因，使其产生_。,（3）将切下的目的基因片段插入质粒的_处，再加入适量_，形成了一个重组DNA分子（重组质粒）,限制酶,黏性末端,同一种限制酶,的黏性末端,切口,DNA连接酶,相同,1.过程:,二、构建表达载体,核心,质粒,目的基因,限制酶,基因表达载体的构建,思考：作为基因工程表达载体，只需含有目的基因就可以完成任务吗？,不可以。因为目的基因在表达载体中得到表达并发挥作用，还需要有其他控制元件，如启动子、终止子和标记基因等。,2.基因表达载体的组成：,它们所处的位置和有什么作用？,a、目的基因,b、启动子,c、终止子,d、标记基因,位于基因的首端,是mRNA结合位点,位于基因的末端,终止转录,检测目的基因是否导入受体细胞,启动子：终止子：标记基因：,位于基因首端的一段特殊的DNA片段，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA。,位于基因尾端的一段特殊的DNA片段，能终止mRNA的转录。,鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将有目的基因的细胞筛选出来。,3、基因表达载体的作用,a、使目的基因在受体细胞中稳定存在并遗传给子代,b、同时使目的基因能表达和发挥作用,载体与表达载体的区别：二者都有标记基因和复制原点两部分DNA片段。表达载体在载体基础上增加了目的基因、启动子、终止子三部分结构用到的工具酶：既用到限制酶切割载体，又用到DNA连接酶将目的基因和载体拼接，两种酶作用的化学键都是磷酸二酯键启动子、终止子对于目的基因表达必不可少目的基因不能单独进入受体细胞，必需以表达载体的方式携带进去。,注意,目的基因与运载体结合所需的条件有同一种限制酶具有抗性基因的质粒RNA聚合酶目的基因DNA连接酶四种脱氧核苷酸ATPABCD,（多选）一个基因表达载体的构建应包括A目的基因B启动子C终止子D标记基因,D,下列关于基因表达载体的叙述不正确的是A启动子是与RNA聚合酶识别和结合的部位，是起始密码B启动子和终止子都是特殊结构的DNA短片段，对mRNA的转录起调控作用C标记基因是为了鉴别受体细胞中是否有目的基因从而便于筛选D基因表达载体的构建视受体细胞及导入方式不同而有所差别,三、将目的基因导入受体细胞,转化,方法,导入植物细胞,导入动物细胞,导入微生物细胞,农杆菌转化法：双、裸,基因枪法：单,花粉管通道法,显微注射法,感受态细胞,目的基因进入_内，并且在受体细胞内维持_和_的过程,受体细胞,稳定,表达,整合到染色体上,转移至受体细胞,1、将目的基因导入植物细胞,（1）农杆菌转化法,特点:,能感染双子叶植物和祼子植物,对大多数单子叶植物无感染能力,Ti质粒的TDNA可转移至受体细胞并整合到其染色体上,转化过程:,Ti质粒目的基因,构建,表达载体,植物细胞,植物细胞染色体DNA,新性状,农杆菌,（2）基因枪法,基因枪法又称微弹轰击法，是利用压缩气体产生的动力，将包裹在金属颗粒表面的表达载体DNA打入受体细胞中，使目的基因与其整合并表达的方法。,常用于单子叶植物的转化方法,（2）基因枪法微弹轰击法,特点：成本高,适用于单子叶植物,胚珠,花药,花丝,柱头,花柱,子房壁,子房,雄蕊,雌蕊,（3）花粉通道法,植物花粉在柱头上萌发后，花粉管要穿过花柱直通胚囊。花粉管通道法就是在植物受粉后，花粉形成的花粉管还未愈合前，剪去柱头，然后，滴加DNA（含目的基因），使目的基因借助花粉管通道进入受体细胞。,我国转基因抗虫棉就是用这种方法获得,2.将目的基因导入动物细胞,（1）方法：显微注射法（将基因表达载体提纯，用显微仪注射到受精卵中）,思考：为什么要用受精卵而不用体细胞？,（2）操作程序:,提纯含目的基因表达载体,取受精卵,显微注射,移植到输卵管或子宫,胚胎早期培养,新性状动物,3、将目的基因导入微生物细胞,常用法：Ca2+处理,常用菌：大肠杆菌,微生物作受体细胞原因：繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对少,过程：,Ca2+处理大肠杆菌,感受态细胞,表达载体与感受态细胞混合,感受态细胞吸收DNA,比较目的基因导入不同细胞的方法,农杆菌转化法,显微注射法,Ca2+处理法,体细胞,受精卵,原核细胞,1、基因工程中科学家常用细菌、酵母菌等微生物作为受体细胞，原因是A结构简单、操作方便B繁殖速度快C遗传物质含量少、简单D性状稳定、变异少2、基因工程常用的受体细胞有大肠杆菌枯草杆菌支原体动植物细胞ABCD,B,D,3、基因工程是在DNA分子水平上进行设计施工的，在基因操作的基本步骤中，不进行碱基互补配对的步骤是A.人工合成基因B.目的基因与运载体结合C.将目的基因导入受体细胞D.目的基因的检测和表达,C,四、目的基因的检测与鉴定,检查是否成功,检测,鉴定,检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因,检测目的基因是否转录出了mRNA,检测目的基因是否翻译成蛋白质,抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等,方法,方法,方法,DNA分子杂交,分子杂交（注意与上不同之处）,抗原抗体杂交,（一）、检测,1、检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因(关键步骤),.首先取出转基因生物的基因组DNA.用含目的基因的DNA片段用放射性同位素等作标记,以此做探针.使探针和转基因生物的基因组杂交,若显示出杂交带,表明染色体已插入染色体DNA中,（1）方法:,DNA分子杂交,（2）过程:,基因探针，是一段带有检测标记，且序列已知的，与目的基因互补的核酸序列。基因探针通过分子杂交与目的基因结合，产生杂交信号，能从浩翰的基因组中把目的基因显示出来。,？,1、探针需带有一定的标记，可以用什么方法？2、基因探针有哪些用途？,DNA分子杂交示意图,采用一定的技术手段，将两种生物的DNA分子的单链放在一起，如果这两个单链具有互补的碱基序列，那么，互补的碱基序列就会结合在一起，形成杂合双链区；在没有互补碱基序列的部位，仍然是两条游离的单链。,P15思考与探究,（二）、鉴定（个体生物学水平）,2、检测目的基因是否转录出了mRNA,3、检测目的基因是否翻译成蛋白质,抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等,方法:,分子杂交,方法:,抗原抗体杂交,过程:用上述探针和转基因生物的mRNA杂交,若出现杂交带,表明目的基因转录出了mRNA,目的基因的表达和检测,抗虫鉴定抗病鉴定活性鉴定等,抗原抗体杂交法,DNA-RNA分子杂交法,DNA分子杂交法,目的基因导入受体细胞后，是否可以稳定维持和表达其遗传特性，只有通过鉴定和检测才能知道。下列属于目的基因检测和鉴定的是检测受体细胞中是否有目的基因检测受体细胞中是否有致病基因检测目的基因是否转录出