发育生物学第五周.ppt

胚胎发育与程序性细胞死亡,湘雅医学院组胚教研室张彬,第八章,一、程序性细胞死亡PCD（programmedcelldeath）,又称细胞凋亡(apoptosis)（在体内外因素诱导下，由基因严格调控而发生的自主性细胞有序死亡。）,1、概念一个固有的遗传程序即生物钟，在一个受控制的时间和空间内激活，从而导致细胞死亡。,细胞凋亡与程序性细胞死亡,意义大致相同，二者可交互使用。比较说来程序性细胞死亡侧重于发育学功能上描述；强调死亡发生的时间；适用于胚胎细胞。细胞凋亡偏重于病理形态描述；强调细胞死亡的方式；适用于所有细胞。,蝌蚪尾的消失脊椎动物的神经系统的发育发育过程中手和足的成形过程,2、简史,1885年，Flemming第一个描述有关细胞凋亡的特征；（染色质浓缩形成半月形）1914年，Graper用这种死亡现象解释胚胎发育中器官收缩等现象1951年，Glucksmann发现在胚胎发育中存在这种死亡，并详细描述；60年代，Lockshin和Williams首次提出程序性细胞死亡这一概念,1986年，RobertHorvitz等发现线虫中ced3（caspase），ced4（Apaf-1）是促凋亡基因。,1980年，Wyllie等发现细胞凋亡与内源性核酸内切酶激活有关。“DNAladder”是细胞凋亡发生的标志；,1965年，JohnKerr提出“固缩性坏死”概念；1972年，Kerr，Wyllie，Currie提出“细胞凋亡”（apoptosis）的概念；,SydneyBrennerH.RobertHorvitzJohnSulston,THE2002NOBELPRIZEWINNER,王晓东：最年轻美国科学院院士,从事的是细胞凋亡机制的研究。1996年，发现线粒体释放细胞色素C,引起细胞凋亡;2000年，发现线粒体释放Smac，可促细胞凋亡.,Smac:Secondmitochondria-derivedactivatorofcaspase,二、PCD/细胞凋亡的形态变化,(1)细胞皱缩变圆，微绒毛、复合体消失；出芽(budding),膜空泡化（blebbing),出芽(budding),(2)胞质浓缩、细胞器结构保留,(3)核浓缩；染色质凝聚,（4）形成凋亡小体,(4)凋亡小体形成胞膜皱缩内陷，分割包裹胞质(内含DNA物质及细胞器)，形成的膜包颗粒即凋亡小体（apoptosisbody）,(5)吞噬,巨噬细胞吞噬凋亡小体,巨噬细胞,凋亡小体,三、PCD/细胞凋亡的生理和生化变化,磷脂酰丝氨酸外翻：annexinV基因转录和蛋白质合成：与细胞骨架降解有关的酶谷胱甘肽转移酶、组织蛋白酶D、组织型纤维蛋白酶原激活剂等与细胞和凋亡小体形态维持有关的蛋白质簇因子、r-谷丙转氨酶等Ca2+、Mg2+依赖性的核酸内切酶活化：降解DNA，形成180-200bp或其倍数的DNA片段,PCD/细胞凋亡与坏死的区别,细胞坏死(necrosis),指由于某些外界毒性刺激（如局部缺血、高热、物理和化学损伤或生物的侵袭等），直接作用于细胞导致的细胞急速死亡，一般伴有炎症反应。,一般过程：因补体反应或烈性病毒感染破坏了质膜，或者能量依赖性离子泵被破坏产生的钠钾等离子沿着各自的浓度梯度进入细胞，从而导致细胞吸水膨胀，最终破膜而死。,细胞凋亡与细胞坏死是多细胞生物细胞死亡的两种不同形式，在形态学、生化代谢、分子机制、结局和意义等方面都有本质的区别。,细胞坏死特征：溶酶体释放酶，细胞器瓦解，细胞骨架降解，细胞核破裂、降解，蛋白质合成终止，由于膜破裂，出现炎症反应,图82细胞凋亡与细胞坏死的比较,表81细胞凋亡与细胞坏死的比较,三、胚胎发育中的程序性细胞死亡（PCD）（一）PCD参与了各器官的形态发生和发育。1、肢体的发生2、中枢神经系统的发生、发育3、腭的发生4、管（腔）道的形成5、晶状体的发育6、心的发育7、生殖细胞的发生8、免疫、造血系统的发生9、无用结构的退化消失（弓动脉、前肾、中肾、尾芽、鳃膜等）,实验,将17期的鸡胚翅芽后缘的细胞移植到另一不同胚龄鸡胚的体节中，发育至24期时仍发生死亡。将17期的鸡胚翅芽后缘以外的细胞移植到另一不同胚龄鸡胚的体节中，发育至24期时不发生死亡。证明鸡胚翅芽后缘细胞的死亡有着预定的时间和空间程序。,（二）胚胎发育中PCD的意义1、系统匹配淘汰没有作用或不再起作用的细胞，以确保有功能细胞的营养和空间。2、除去短暂结构：人胚尾芽3、雕刻躯体从而形成正常、精细复杂的生物体。4、保护机体：如胸腺的发育、损伤的胚胎细胞,四、PCD/细胞凋亡的调节,（一）激素水平的调节：甲状腺素（蝌蚪）、糖皮质激素（胸腺cell）、苗勒抑制物质（中肾旁管）等诱导PCD雌激素及卵泡刺激素（颗粒细胞）、胰岛素（晶状体上皮细胞）等抑制PCD（二）细胞因子调节主要是生长因子：NGF，FGF，TGF，G-CSF等缺乏导致PCD,（三）PCD相关基因/蛋白的调节1、TNF死亡受体超家族（1）死亡受体：Fas、TNFRI等（2）与死亡受体有关的含死亡结构域的信号蛋白：FADD（FAS相关死亡蛋白）、TRADD（TNFRI相关死亡蛋白）等,（1）死亡受体：Fas、TNFRI等结构特点：胞内C-端：胞内功能区由80个氨基酸构成的死亡结构域（deathdomain，DD）跨膜区胞外N-端：胞外功能区内含数个半胱氨酸,（2）含有死亡结构域的信号蛋白TRADD（TNFR相关死亡蛋白）：34kD，C端的DD与TNFRI，FADD的DD结合FADD（Fas相关死亡蛋白）（MORT-1）：23kD，C-端含有一个DD(deathdomain)，可与Fas结合；N-端含有MORT结构域或死亡效应结构域（DED:deatheffectordomain），可与proCaspase-8（FLICE）的DED结合,Fas(Apo-1,CD95):43kD（三聚体FasL-Fas-FADD（Fas相关死亡蛋白）-proCaspase-8）(DISC/死亡诱导信号复合物):活化Bid、caspase-3DED:deatheffectordomainTNFRI（TNFR55）：55-60kD，TNFRI-TRADD（TNFR相关死亡蛋白）-FADD-proCaspase-8,DD,DED,DD,DD,DED,Fas/FasL,DD:deathdomain,凋亡诱导因素,死亡受体（Fas)配体（FasL)的表达、结合,Caspase-8活化,Caspase-3活化,apoptosis,FADD,FADD,2.凋亡蛋白酶,Caspase:cysteine-containingaspartate-specificprotease（含半胱氨酸的天冬氨酸特异蛋白水解酶）,一组对底物的天冬氨酸部位有特异水解作用，其活性中心富含半胱氨酸的蛋白酶。,(1)定义,（2）Caspase的分类及功能凋亡启动亚类(DED、CARD)凋亡效应亚类细胞因子加工亚类（ICE亚类）,Caspases激活的瀑布学说(级联反应),(3)结构特征,以无活性的酶原形式存在；,N端均含有一段前区域（内含DED、CARD)；,CARD:CaspaseActivationandRecruitmentDomain,在大亚基的C端含有一活性中心，其中半胱氨酸是必需氨基酸。,活性形式由2个大亚基和2个小亚基组成的杂四聚体；,(4)Caspase的作用底物,凋亡蛋白酶激活的DNA酶抑制物(ICAD),CAD:CaspaseActivatedDNase由Caspase激活的核酸酶(具有内切酶活性),ICAD,CAD,DNA,Caspase,核纤层（lamina）蛋白,细胞核,lamina,染色体,细胞骨架蛋白：导致细胞解体，形成凋亡小体其他的caspases灭活细胞凋亡的抑制物,3、凋亡蛋白酶活化因子-1（Apaf-1)130kD，N-端含有一半胱氨酸蛋白酶募集域（CARD），C-端由12个WD-40重复片段组成。凋亡体/死亡复合体：Cytc-Apaf-1-dATP（闭合的单体聚合成开放的七聚体）Cytc-Apaf-1-dATP-proCaspase-9,凋亡复合体,CARD:CaspaseActivationandRecruitmentDomain,4、线粒体膜间隙蛋白（线粒体释放的凋亡相关因子）细胞色素C，凋亡诱导因子，Apaf-1,Ca2+,Smac/DIABLO等5、自由基活性氧自由基（超氧阴离子自由基、羟自由基及单线态氧，H2O2等）：诱导PCD的发生。活性氮自由基：NO高浓度促PCD，低浓度抑制PCD,6、P53基因,阻滞细胞G1期，修复受损的DNA，如修复失败则通过多种途径诱导细胞凋亡。,（射线、毒素）,分子警察,P53的促凋亡机制：,（1）DNA结合蛋白，调控基因（BAX等)转录（细胞核途径）,（2）激活线粒体途径（3）诱导Fas增加（4）诱导溶酶体的不稳定性,7、BcL-2家族,3个亚家族,抗凋亡蛋白亚家族（BcL-2亚家族）,含多区域的促凋亡蛋白亚家族（Bax亚家族）,仅含BH3区域的促凋亡蛋白亚家族（BH3亚家族）,基本结构特征：跨膜结构域BcL-2同源结构域（BH）,BcL-2基因家族成员自身或彼此之间有形成二聚体或多聚体的能力，BcL-2家族通过蛋白与蛋白相互作用调节着细胞的存活与凋亡。,Bcl-2（Bcelllymphoma/leukemia-2）：Bcl-2是第一个被确认有抗凋亡作用，由229aa构成（鼠236）分布在线粒体膜,内质网，核膜等处。Bcl-2和C.elegans中的ced-9有很高的同源性，具有促进细胞存活的功能。,BcL-2抗凋亡机制：,直接抗氧化；调节PTP（线粒体通透性转换孔）开放；抑制Bax，Bak的促凋亡作用；抑制Caspases激活；维持细胞钙稳态。,8、凋亡抑制蛋白家族（IAP家族）,IAP家族是一组抑制凋亡的蛋白。IAP家族蛋白的主要结构域：BIR（baculoviralIAPrepeat),锌指结构域、CARD。BIR2是IAP抑制凋亡的结构基础。作用机制：抑制caspase-3,7,9等的活性。,Figure1SchematicdiagramofdomainstructureinrepresentativeIAPs,凋亡细胞DNA的断裂,形成高分子量的DNA大片断（50kb),形成180200bp整数倍的DNA小片断,非Caspase依赖的内源性核酸内切酶的激活,Caspase依赖的内源性核酸酶激活(CAD),9.核酸内切酶,Caspase8,Caspase3,Caspase9,Cleavageofsubstrates,Nucleus,DegradationofDNA,CAD激活方式,细胞膜,DNA断裂与“梯状条带”,DNA“梯”状条带,（二）、PCD的主要途径1.膜受体通路(死亡受体通路/外源性通路),肿瘤坏死因子死亡受体(TNFR)家族中的,死亡受体：FasCD95，TNFR,Fas/FasL,DD:deathdomain,死亡受体通路,凋亡诱导因素,死亡受体（Fas)配体（FasL)的表达、结合,Caspase-8活化,Caspase-3活化,apoptosis,FADD,FADD,2.线粒体通路（内源性途径）线粒体通透性转换孔（MPTP）：由内膜的腺苷转位因子和外膜的电压依赖性阴离子通道）构成的蛋白复合体。,R,1、线粒体跨膜电位（m）的破坏与细胞凋亡的一致性；m下降时PTP开放导致细胞凋亡m正常时无细胞凋亡2、线粒体跨膜电位（m）的破坏早于核DNA的断裂。,?,?,线粒体信号通路,smac,Smac:secondmitochondria-derivedactivatorofcaspase,IAPs,(-),Apoptosisinducingfactor,Inhibitorsofapoptosisprotein,apoptoticproteaseactiviationfactor,凋亡诱导因素,死亡受体/配体的表达、结合,Caspase-8活化,Caspase-3活化,apoptosis,Bid活化,线粒体通路活化,死亡受体通路与线粒体通路的联系,Caspase-3活化,3、内质网应激反应性途径,损伤因素-内质网钙离子稳态改变、非正确蛋白质堆积-caspase12活化-活化Bcl2促凋亡亚家族成员-线粒体通透性增加-caspase9活化-凋亡发生活化caspase12与其他的内质网应激分子协同，直接活化caspase9-凋亡发生,4、MAPK、JAK-STAT信号转导途径,MAPKKK（MEKK1、2、3、4）MAPKK（MEK1-7）MAPK（丝裂原活化蛋白激酶，包括ERK、JNK、P38MAPK、ERK5/BMK1)转录因子（c-myc、c-fos、c-jun等）,JAK（两面神激酶）-活化STAT（信号转导子