从单酶切到双酶切看目的基因与运载体结合的准确率

从单酶切到双酶切看目的基因与运载体结合的准确率 唐晓明?(江苏省苏州中学园区校? 215021) ? ? 2008年江苏省和海南省高考、 2009年江苏省高考 生物学试卷都考查了基因工程的酶切过程。题目新 颖, 体现了生物科学的时代特征。学生普遍反映难。 究其原因, 人教版教材 (选修 3)叙述的是早期基因工 程的 ? 单酶切 ?, 而高考试卷讨论是现代基因工程的 ?双酶切 ?以及 ?双酶切 ?的优势, 两者落差较大。怎样 使复杂的问题简单化? 在一节高三复习课中, 笔者对 2008年江苏省和海南省的两个高考题进行了重组和 改编, 分析基因工程从单酶切到双酶切, 究竟发生了怎 样的变化? ( 2008江苏第 32题 )将动物致病菌的抗原基因导 入马铃薯制成植物疫苗, 饲喂转基因马铃薯可使动物 获得免疫力。下图是与植物疫苗制备过程相关的图和 表。请据图表回答。 表 1? 几种限制识别序列及切割位点表 限制酶Alu IEcoR IPst ISma I 切割位点 AG?CT TC? GA G?AATTC CTTAA? G GTGCA?G G? ACGTC CCC?GGG GGG? CCC ? ?( 1)如果目的基因和载体质粒都用一种酶切 (如 EcoR I), 且目的基因的两端都有 EcoR I的酶切位点, 酶切产物用 DNA 连接酶进行连接后, 其中由两个 DNA 片段之间连接形成的产物有种, 其中环状产物 有、3种 。 在授课前, 为每个学生准备了已经打印了含有 ?抗 原基因的染色体 DNA?和 ?载体质粒 ?图的纸片, 上课时 每人发了一把小剪刀 (相当于限制性核酸内切酶 )、 胶带 纸 (相当于 DNA连接酶 )。用 EcoR I酶切含有抗原基因 的染色体 DNA, 可以得到 3个 DNA片段, 分别为片段 A、 B(含目的基因 )、 C; 用 EcoR I酶切载体质粒, 得到片段 D。酶切产物用 DNA 连接酶进行连接后, 其中由两个 DNA片段之间连接形成的产物有 10种, 分别是: AA、 BB 、 CC、 DD、 AB 、 AC 、 AD、 BC 、 BD和 CD。 ? ? 其中环状产物有目 的基因和目的基因连接物 物质浓度低的情况下, 可到窗口光线明亮处, 在两只试 管后加一张白纸作为背景, 可顺光观察到实验试管呈 现淡淡蓝色 (对照试管为无色 )。时间 8m in。 ( BB)、 载体质粒和载体质粒连接物 (DD)、 目的基因和 载体质粒连接物 ( BD) 3种。其中 BB、 DD是自身环化 的结果。如果考虑正向连接和反向连接, BB、 DD 和 BD又各有两种连接方式。 ( 2)如果目的基因和载体质粒都用一种酶切 (如 用 EcoR I切 ), 在 DNA连接酶的作用下, 则目的基因与 载体质粒进行连接后的连接方式有种。 由于 DNA测序技术和电泳技术的成熟, 含有抗原 基因的 DNA酶切后, 可以准确的回收目的基因片段。 现代基因工程还采取一些方法防止目的基因和运载体 的自身环化 (如将酶切过的线性目的基因和载体双链 的 5?端经碱性磷酸酶处理后去磷酸化; 仔细调整反应 混合物中两种 DNA片段的浓度比例, 以便使所需要的 连接产物的数量达到最佳水平等 )。则在 DNA连接酶 的作用下, 目的基因与载体质粒进行连接后的连接方 式有 2种。 ( 3)如果目的基因和载体质粒用 EcoR I和 Alu酶 切, 在 DNA 连接酶的作用下, 则目的基因与载体质粒 进行连接后的连接方式有种。 ?36?生物学教学2010年 (第 35卷 )第 7期 让学生在载体质粒上增加了 Alu酶切位点 (如上 图 ), 重新完成 ?剪切 ?和 ?拼接 ?的过程, 则目的基因和 载体质粒形成的环状产物同样是 3种, 但各只有一种 连接方式。同样, 如果能够避免自身环化, 则目的基因 与载体质粒结合产物只有 1种、 连接方式也只有 1种。 可见: ?单酶切 ?, 目的基因与运载体连结方式有 2 种; ?双酶切 ?, 目的基因与运载体连结方式只有 1种。 ? ? 2009年江苏卷 (第 34题 )再次出现了基因工程的 试题, 重点还是考查了酶切的变化: 苏云金杆菌 ( Bt)能 产生具有杀虫能力的毒素蛋白。下图是转 Bt毒素蛋 白基因植物的培育过程示意图 ( amp r 为抗氨苄青霉素 基因 ), 据图回答下列问题。 单酶切和双酶切的比较 目的基因与运载体的连结单酶切 双酶切 环状产物种类33 每种环状产物的连接方式21 避免自身环化处理后环状产物种类11 避免自身环化处理后环状产物的连接方式21 ? ?( 1)图中 ? 表示 H ind III与 Bam I酶切、 DNA连接 酶连接的过程, 此过程可获得种重组质粒; 学生有了前面手工操作的基础, 下面我有意培养 学生的画图能力, 同时让学生获得解决同类问题的一 般解决方法: 只有 1种连接方式, 得到 1种重组质粒。 ( 2)如果换用 Bst l与 BamH l酶切, 目的基因与质 粒连接后可获得种重组质粒。 或 有 2种连接方式, 得到 2种重组质粒。 同样是双酶切, 为什么又有差别呢? 原来 Bst l与 Bam H