荧光PCR原理与应用-广州.ppt

荧光PCR原理与应用,荧光原理,荧光信号的种类,荧光染料直接结合扩增产物荧光标记引物特异性荧光探针,荧光信号的产生,Fluorescenceresonanceenergytransfer(FRET),荧光标记基团在激发光刺激下生成某波长的发射光，当另一屏蔽基团与其距离合适时，原发射光将会被屏蔽基团所吸收，并转化为其他波长的发射光或热能，称之为FRET。,荧光信号的淬灭-FRET原理,Taqman探针,Taqman探针技术,结果分析的两重要参数,荧光阈值（threshold）：荧光本底设定PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光阈值的默认设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍。Ct值：C代表Cycle，t代表threshold，Ct值的含义是：每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。,ThresholdandCt,定量原理和方法,原理：每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析.。外标法：将几个已知拷贝数的纯化的目的基因标准品进行FQ-PCR扩增，绘制荧光定量标准曲线。内标法：将已知浓度的内标基因加到各标本中，与标本一起经历核酸提取、加样、逆转录、PCR扩增及信号检测的全过程，比较内标最后的实测值与已知值，以检验标本中是否存在抑制PCR的因素，也可对样品的拷贝数加以校正。,外标法,未知样本拷贝数的确定,基于其它探针的荧光PCR原理,SYBRgreenI染料Taqman-MGB探针Molecularbeacon杂交探针技术置换探针技术,SYBRgreenI染料,Taqman-MGB(MinorGrooveBinder),Molecularbeacons,Molecularbeacons,Molecularbeacons,杂交探针技术,杂交探针技术,置换探针技术,荧光PCR技术的特点,特异性强灵敏度高在线式实时监测荧光量变化，摒弃常规PCR受多因素干扰的终点分析法，使定量更准确可靠全封闭反应，不需PCR产物后处理，避免了模板的污染隐患可实现单管双检或多检不接触有毒试剂，操作安全,荧光技术应用举例,SureDT志贺氏菌实时荧光PCR检测试剂的研制,研究的技术路线,志贺氏菌简介,志贺氏菌分为福氏志贺氏、鲍氏志贺氏、痢疾志贺氏、宋内志贺氏四大类，其引起的细菌性痢疾，又称志贺菌病，主要通过消化道途径传播。志贺氏菌病在全世界范围分布，估计每年有16,470万例病例，大多数发生在发展中国家，有110万人因此而死亡。在所有发病人数中有69%是不满5岁的儿童。,志贺氏菌国标法检验程序,靶基因的确定,文献检索表明，ipaH基因是志贺氏菌的特异序列，该基因决定志贺氏菌对大肠粘膜的上皮细胞侵的袭能力。以ipaH基因为检测靶基因的普通PCR检测法可以检测出全部四种志贺氏菌和少量大肠杆菌。通过对ipaH基因序列的排序和比对，发现该基因有一段序列在志贺氏菌内高度保守，相对于其它物种则高度特异，符合靶基因及引物探针的设计要求。,靶基因ipaH序列Blast比对结果