遗传疾病与基因治疗基础知识概述

遗传疾病与基因治疗,廖宇静,遗传疾病,单基因缺陷多基因遗传病染色体遗传病生化遗传病线粒体基因病,单基因缺陷,也称为孟德尔紊乱（Mendliandisorder）、单基因紊乱（monogenticdisorder）或单基因座紊乱（singlelocusdisorder）。突变基因：常染色体、性染色体上可显性遗传，也可隐性遗传。苯硫脲的尝味能力的突变就是典型的单基因突变。,多基因遗传病,糖尿病冠状动脉硬化等,染色体遗传疾病,是由染色体结构或数目变异造成的。其中非整倍体较为常见。Down综合征有21三体、46/47嵌合体和易位型（14；21易位个体）。Edward综合征，即18三体。Payau综合征即13三体。猫叫综合征即第五染色体短臂缺失所致。,生化遗传病,1902年英国科学家ArchibaldGarrod首先报道了尿黑酸代谢疾病，1909年他出版了先天性代谢差错一书，在该书中系统地阐述了代谢病的遗传基础，以及基因与酶的相互关系，他把人类生化失调现象与遗传规律紧密地结合起来。因为他的功绩，人们尊称他为先天性代谢研究之父。尿黑病，是尿黑酸氧化酶缺乏所致。白化病是酪氨酸酶缺乏，不能形成黑色素所致。苯丙酮症是不能形成苯丙氨酸羟化酶，不能将苯丙氨酸转化为酪氨酸，在血液中积累苯丙氨酸导致苯丙酮症。半乳糖血症是是一种乳糖代谢紊乱，涉及到半乳糖激酶、半乳糖-1-磷酸尿苷酰转移酶、尿苷二磷酸半乳糖-4-差向异构酶等多种酶，其中任何一种酶出现缺陷，都可以导致不同亚型的半乳糖血症。生化遗传病有的是单基因遗传，有的是多基因遗传。生化遗传病多数是常染色体隐性遗传，大部分是伴X性隐性遗传。只有少部分是常染色体显性遗传。,血红蛋白分子病,1949年L.Pauling发现廉形细胞贫血症中的变异的血红蛋白S，并第一次提出了分子病的概念。1959年Ingram等证实了HbS的结构变异，即血红蛋白的链的第六位氨基酸，由谷氨酸变成了缬氨酸。从那以后到目前已经发现血红蛋白异常的有400多种。已知的分子病有凝血性疾病、补体系统缺陷、胶原蛋白异常，受体蛋白异常等159种。,血红蛋白病大致分类,异常血红蛋白疾病：有链、链、链和链异常的不同种类。血红蛋白异常种类有471种，链异常的有144种链异常的有259种链异常的有17种链异常的有42种同时涉及两条链异常的有9种。地中海贫血病（thalassemias）是由于一种或多种珠蛋白合成速率降低，以致一些肽链缺乏，另一些肽链相对过剩，出现肽链数量上不平衡，从而导致溶血性贫血。,异常血红蛋白疾病原因,单个碱基替换：如异常血红蛋白HbE是链第26位的谷氨酸被赖氨酸取代；密码子缺失或插入：HbGrady是链第116118插入了谷-苯丙-苏氨酸所致；移码突变：HbTak是第146147个氨基酸密码子之间插入了AC，使终止密码子UAA变成了苏氨酸密码子ACU，肽链延长至147个氨基酸。融合基因：HbLepore是非链由链与链连接而成，其中N端为链的序列，C端为链的序列，这是减数分裂时发生不等交换所致。终止子突变：Hbconstantspring(HbCS)是链142位终止密码子UAA变成CAA，终止密码子处翻译成谷氨酰氨，肽链一直延长至173个氨基酸。无义突变：HbMcKees-Rock的链丢失了C端的两个氨基酸，链第145个酪氨酸密码子UAU变成了终止密码子，所以肽链只能合成至144个氨基酸处。,地中海贫血症分类,链的地中海贫血症：链地中海贫血症主要是定位于人的第16号染色体短臂上的两个连锁的链的珠蛋白基因缺失所致；链的地中海贫血症：血红蛋白链的减少或缺失所致。,线粒体基因病,线粒体基因病是线粒体基因组发生基因突变所产生的一类遗传病。其传递与表达不同于核基因遗传。遗传性视神经（Leberhereditaryneropathy,LHON）是典型的线粒体基因病。线粒体呼吸链复合物遗传异常而引发的遗传性疾病。患者初期为急性或亚急性眼球神经炎，随后引发严重的双侧视神经萎缩和大片中心暗点，使视力突然丧失，伴随有色盲障碍。此病的发病高峰年龄为2025岁，但在任何年龄都可以发病，一般无特殊的并发症。,线粒体基因病的原因,是mtDNA发生了重复或缺失或点突变，呈现母性遗传的特点。线粒体基因疾病的传递与发病机理还有待进一步研究：如当一个细胞中大量的线粒体DNA就某个基因座而言，一般是杂性的，原则上不会致病，那么是什么机理使个别发生突变的mtDNA在卵细胞中逐步积累以致使子代发生线粒体基因病的呢？从细胞质的传递规律看，母体传递给子代的线粒体的机会理论上是均等的，但为什么LHON线粒体基因病的患者男性多于女性，对于这些现象尚无合理的解释。,人类疾病的基因诊断与基因治疗,基因诊断基因治疗基因治疗的成果与展望,基因诊断,基因诊断又称为DNA诊断，是利用重组DNA技术，直接从DNA水平上来检测人类遗传性疾病中的基因缺陷，从而作出判断基因诊断的基本原理基因诊断基本技术及其应用,基因诊断的基本原理,应用人类标准基因图谱或功能蛋白基因基因图谱与受试者的基因图谱进行比较、分析与预测，不论缺陷基因是否已经表达，便能鉴定缺陷基因的有无。能够检测单个碱基置换、缺失和插入等还能发现DNA的多态现象以及遗传病的异质性及早发现易感基因位点,基因诊断的基本方法,DNA点杂交限制性内切酶图谱直接分析法限制性片段长度多态性（RFLP）分析寡聚核苷酸探针杂交分析法PCR法,DNA点杂交,变性：把受检者DNA变性成单链转膜杂交：单链DNA直接点样在硝酸纤维膜上，与标记的基因探针作固相分子杂交，检查结果：根据杂交结果是否是阳性及阳性强度，来检测基因是否存在以及基因的数目。此法的优点：比较简便快捷，可适用于诊断基因缺失的遗传疾病。例子：如正常人的细胞中有4个珠蛋白基因，根据受检者DNA与P32标记的珠蛋白基因探针杂交后再按放射自显影图上的强度与其基因数量成正比的原理，便可检测出珠蛋白基因是否缺失和缺失的程度，以确定有无地中海贫血症及该病的相应类型。技术的关键：是克隆一批能用于检测人类遗传疾病基因诊断的探针，制作成为诊断芯片。,适用于典型遗传疾病确知疾病基因通过芯片探针检测,限制性内切酶图谱直接分析法,是应用专一性探针和限制酶，直接针对存在疾病基因内部的突变进行检测。可检测出点突变导致的限制性位点的改变和包括大的DNA片段缺失和插入的基因序列的重排。例子：限制酶Mst所识别的DNA碱基序列是CCTGAGG，而这是正常珠蛋白基因（A）第六个密码子前后的碱基序列。经Mst切开形成1.15kb和0.2kb两个片段。正常珠蛋白基因突变成为镰形细胞贫血症基因（S）时，第六个密码子GAG突变成为GTG，于是CCTGAGG变成CCTGTGG，而不能被Mst所识别，以致酶切时产生1.35kb的DNA片段。根据这一特点，可以对镰形细胞贫血症进行基因诊断,突变位点或易感基因,限制性片段长度多态性（RFLP）分析,利用人群个体的DNA碱基序列的多态性特征进行诊断。大约每100200个碱基中就有发生中性替代而出现多态性。多态性并不引起疾病，却影响到限制酶的切点改变。RFLP呈孟德尔式遗传，RFLP作为染色体上疾病基因座位的标记基因，通过RFLP的连锁分析，对疾病进行间接诊断，来推测一个家庭成员和胎儿是否携带有遗传病。我国在20世纪80年代中期已应用这一技术成功地进行了地中海贫血病、苯丙酮尿症等遗传病的基因诊断。RFLP连锁分析是一种十分有用的遗传病诊断技术，适用于诊断任何一种单基因遗传病。即使突变的遗传病基因序列或基因产物还不清楚，但只要找到和突变基因连锁的RFLP基因座，就可以利用RFLP连锁分析进行遗传病的基因诊断和产前诊断。有人提出如果建立起一套以20cM间隔的平均分布于整个基因组的RFLP基因座，并选用合适的探针，就有可能对所有的遗传病进行基因诊断。,易感基因，多态性,寡聚核苷酸探针杂交分析法,根据已知疾病基因突变结构和相应的正常基因结构，在体外人工合成一段1619bp的疾病基因探针和同样大小的相应正常基因片段的寡聚核苷酸探针，并分别与被检者杂交，从而直接显示疾病基因是否存在以及存在的状态。这一方法对遗传病进行诊断，既不受突变是否涉及限制酶切位点的限制，又不必预知患者父母是否生育过患儿，因此在产前诊断中更有价值。世纪年代末，上海儿童医院应用这一技术对上海等几个省市的地中海贫血症家系进行了分析鉴定，并对高危妊娠胎儿进行产前基因诊断。,疾病直接诊断,基因治疗,概念：基因治疗（genetherapy）是将具有防治功能的外源基因（目的基因）通过适当载体转移到患者的相应器官组织（靶组织），并进行表达，以获得防治疾病的疗法。基本原理：基因治疗是将外源基因作为药物导入体内靶组织，在体内表达产生特定的活性因子（如细胞因子等），也可以将其看做是导入一个具有治疗作用的给药系统。条件：1）获得目的基因；2）选定靶组织；3）确定将目的基因导入靶组织的方法和途径。,基因治疗途径,遗传病的基因治疗是指应用基因工程技术将正常基因直接引入患者细胞内，以纠正致病基因的缺陷而根治遗传病。纠正的途径:原位修复缺陷的基因，用有功能的正常基因转入细胞基因组的某一部位，以互补替代缺陷基因来发挥作用，一般利用基因芯片来实现。,基因治疗的基本步骤,目的基因获得目的基因导入或转移目的基因表达目的基因的寿命,目的基因获得,疾病基因与疾病修复基因的比对人工合成基因文库钓取cDNA合成PCR合成制作芯片,目的基因转移方法,病毒方法非病毒方法,RNA和DNA病毒都可作为基因转移的载体。常用的有反转录病毒载体和腺病毒载体。转移的基本过程是将目的基因重组到病毒基因组中，然后把重组病毒感染宿主细胞，以使目的基因整合到宿主基因组内。,磷酸钙沉淀法脂质体转染法显微注射法等。,目的基因的表达,目的基因的表达是基因治疗的关键之一。可运用连锁基因扩增等方法适当提高外源基因在宿主细胞中的拷贝数。在重组病毒上连接启动子或增强子等基因表达的控制信号，使整合在宿主基因组中的新基因高效表达，生产所需要的特异性蛋白质，达到基因治疗的目的。可利用质粒稳定遗传技术使其表达。,基因治疗的方式,体细胞治疗法生殖细胞治疗法体外原位基因治疗法体内基因治疗法反义疗法核酶治疗法,安全措施,使新基因在宿主细胞中表达后不危害细胞和人体自身，不引起癌基因的激活和抗癌基因的失活等，尤其是在将反转录载体用于基因转移时，必须在应用到人体前预先在人骨髓细胞、小鼠体内和灵长类动物体内进行类似的研究，以确保治疗的安全性。,恶性肿瘤的基因治疗,基因治疗是肿瘤治疗的一个新领域，主要运用基因工程技术来修复和纠正肿瘤基因的结构与功能的缺陷，或通过增强宿主细胞对肿瘤的杀伤能力和机体防止机制来治疗肿瘤。癌症基因治疗的方案：一是在体外将细胞因子导入肿瘤或宿主细胞，利用细胞因子对免疫系统调节作用的增强，使宿主产生有效的抗肿瘤免疫反应。二是把某些对化学药物敏感的基因导入肿瘤细胞，因该基因对药物的敏感性从而间接杀死肿瘤细胞，目前正在使用的是单纯性疱疹病毒胸苷激酶（HSK-TK）基因。三是利用抑癌基因进行肿瘤治疗。,基因芯片,基因芯片（genechip）是利用大规模集成电路的手段，控制固相合成成千上万个寡聚核苷酸探针，并把它们有规律地排列在指甲大小的硅片上，然后将要研究的材料，如DNA或cDNA用荧光标记后在芯片上与探针杂交，再通过激光共聚焦显微镜对芯片进行扫描，并配合计算机系统对每一个探针上的荧光信号作出比较与检测，从而迅速得出所需要的信息。克服了Southern技术操作烦琐、自动化程度低、检查率低的缺陷,基因芯片的种类,诊断芯片用于疾病诊断检查芯片用于海关等处的商品检疫表达谱基因芯片或治疗芯片用于功能基因检查芯片,基因芯片的应用,基因诊断药物筛选寻找靶基因基因表达谱,DNA指纹鉴定,利用重复序列中不存在切点的限制性内切酶HinfI酶切整个基因组，形成长短不等的DNA片段，电泳后将其分开，然后用肌红蛋白基因的第一内含子中的串联重复序列作为探针，用32P标记探针的核心序列用探针与待测DNA片段进行杂交，不同个体所得到的杂交带不同，通过放射自显影检测杂交带纹，由于不同个体所得到的DNA带纹不同，这种技术即DNA指纹图谱,DNA指纹鉴定的遗传基础,基因组中的重复序列利用VNTR标记,DNA指纹制备,从人体组织和细胞核中分离DNA利用限制性酶切消化DNA利用凝胶电泳分离DNA片段使DNA片段变性通过Southern技术进行转膜固定利用探针与待测DNA杂交通过放射自显影进行鉴定,DNA指纹的遗传特性,没有突变时，同一个体不同组织其DNA带纹相同即便突变，同一个体不同组织的带纹差异很小不同个体带纹差异较大,DNA指纹的应用,孪生的遗传鉴定亲子鉴定身份鉴定,基因治疗的成果,1990年美国国立卫生研究院首次报道用基因治疗的遗传疾病。患者机体不能合成胸苷激酶（ADA）而导致先天性免疫缺陷综合症。治疗中，将正常ADA基因引入患儿体内，产生一定的ADA产物，并检测到治疗前从未产生过的抗体，显示免疫系统趋于正常。国内20世纪90年代开始进行基因治疗的尝试，由复旦大学遗传所与长海医院协作进行的。血友病B临床上的主要表现是自发性或轻微外伤后出血不止，常由于关节、肌肉反复出血以致关节畸型而终生残废，或由于内脏或颅内出血而死亡。,血友病,血友病是由于因子缺乏所导致的一种性连锁隐性遗传性出血疾病。因子是一种糖蛋白，相对分子量为56000，其基因定位于xq26.3q27.1。1982年已克隆了因子cDNA。人完整的因子的cDNA为2802bp，编码序列长1383bp，编码461个氨基酸残基。已证明因子cDNA能在肝细胞以外的多种原代培养细胞和永生