第9章 蛋白质和氨基酸测定.ppt

第9章蛋白质和氨基酸的测定,主要内容,第一节概述第二节凯氏定氮分析法第三节蛋白质的快速分析方法第四节氨基酸总量的测定那个第五节个别氨基酸的定量测定第六节氨基酸的分离分析,第一节概述,一、蛋白质的元素组成C：50-55%N：15-18%O：20-25%H：5-7%S：0.2-0.3%微量元素：P、Fe、Zn、Cu二、基本结构单位：氨基酸,不同的蛋白质其氨基酸构成比例及方式不同，故各种不同的蛋白质其含氮量也不同，一般蛋白质含氮量为16%，即一份氮素相当于6.25份蛋白质，此数值（6.25）称为蛋白质系数。不同种类食品的蛋白质系数有所不同，如玉米，荞麦，青豆，鸡蛋等为6.25，花生为5.46，大米为5.95，大豆及其制品为5.71，小麦粉为5.70，牛乳及其制品为6.38。,三、蛋白质系数,四、蛋白质分析的重要性,评价食品的营养价值优化食品配方指导经济核算及生产过程控制营养标签总蛋白质含量氨基酸组成蛋白质的营养价值,五、蛋白质的测定方法,利用蛋白质共性的方法利用特定氨基酸残基法,福林酚法染色法,凯氏定氮法杜马斯法,第二节凯氏定氮分析法,蛋白质测定方法凯氏定氮法双缩脲法紫外吸收法福林-酚试剂法水杨酸比色法近红外光谱法折光法旋光法目前蛋白质测定最常用的方法是凯氏定氮法,一、凯氏定氮法是通过测出样品中的总含氮量再乘以相应的蛋白质系数而求出蛋白质的含量此法的结果称为粗蛋白质含量：由于样品中含有少量非蛋白质含氮化合物，如核酸、生物碱、含氮类脂、卟啉以及含氮色素等非蛋白质的含氮化合物,（一）常量凯氏定氮法1、原理样品与浓硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解，其中碳和氢被氧化为二氧化碳和水逸出，而样品中的有机氮转化为氨与硫酸结合成硫酸铵。然后加碱蒸馏，使氨蒸出，用硼酸吸收后再以标准盐酸或硫酸溶液滴定。根据标准酸消耗量可计算出蛋白质的含量。包括消化、蒸馏、吸收、滴定四个步骤。,样品消化2NH2-(CH2)2-COOH+13H2SO4(NH4)2SO4+6CO2+12SO2+16H2O浓硫酸的作用：脱水作用使有机物脱水并碳化为C、H、N氧化作用将有机物炭化后的碳氧化为二氧化碳，硫酸则被还原成二氧化硫2H2SO4C2SO22H2OCO2二氧化硫使氮还原为氨，本身则被氧化为三氧化硫，氨与硫酸作用生成硫酸铵留在酸性溶液中。,加入硫酸钾的作用是：提高溶液沸点而加快有机物的分解（3380C4000C）K2SO4+H2SO4=2KHSO42KHSO4=K2SO4+H2O+SO3但硫酸钾加入量不能太大，否则消化体系温度过高，又会引起已生成的铵盐发生热分解而造成损失：（NH4）2SO4=NH3+(NH4)HSO42(NH4)HSO4=2NH3+2SO3+2H2O除硫酸钾外也可加入硫酸钠，氯化钾等盐类来提高沸点，但效果不如硫酸钾。,加入硫酸铜的作用催化作用：加速有机物的氧化分解C2CuSO4Cu2SO4SO2CO2Cu2SO42H2SO42CuSO42H2OSO2此反应不断进行，待有机物被消化完后，不再有硫酸亚铜（褐色）生成，溶液呈现清澈的蓝绿色。消化完全指示：蓝绿色；,蒸馏在消化完全的样品溶液中加入浓氢氧化钠使呈碱性，加热蒸馏，即可释放出氨气(NH4)2SO4+2NaOH2NH3+Na2SO4+2H2O蒸馏时碱性反应完全指示：变深蓝色或产生黑色沉淀,吸收用硼酸溶液，并加入混合指示剂，硼酸呈微弱酸性（Ka1=5.8X10-10），与氨形成强碱弱酸盐2NH3+4H3BO3=(NH4)2B4O7+5H2O,滴定待吸收完全后，再用盐酸标准溶液滴定蓝绿色灰红色(NH4)2B4O7+2HCl+5H2O=2NH4Cl+4H3BO3,2、操作方法（1）样品消化,消化终点,样品+0.5g硫酸铜+10g硫酸钾+20mL浓硫酸+玻珠数粒,先小火炭化，无泡沫后，加大火力，液体变蓝绿透明，继续加热微沸30分钟,45度角,瓶口不能对着人,盖上小漏斗,消化炉,70-80mL，400g/L氢氧化钠溶液,装有消化液；加入氢氧化钠后要求颜色变为深蓝色或产生黑色沉淀,50mL，40g/L的硼砂以及混合指示剂,氨全部蒸出后，提离页面，蒸馏水冲洗，继续蒸馏1min。奈氏试剂检验,奈氏试剂Nessler试剂，K2（HgI4）检验NH4+离子，遇铵根，离子析出黄色或红棕色沉淀。配制方法1：3.5gKI+1.3gHgCl2溶于70毫升水。加30毫升4mol/L氢氧化钠（或氢氧化钾）溶液，必要时过滤，并存于玻璃瓶中盖紧口。配制方法2：溶解11.5gHgI2+KI10g于适量少许水，后加水稀释至50ml,静置后，取其澄清液，弃去沉淀，储存于棕色瓶中。,（3）滴定用4%硼酸吸收，用盐酸标准溶液滴定，指示剂用混合指示剂（甲基红-溴甲基酚绿混合指示剂）国标用亚甲基兰+甲基红。用过量的H2SO4或HCl标准溶液吸收，再用NaOH标准溶液滴定过剩的酸液，用甲基红指示剂。,滴定前,滴定终点,同时做一试剂空白实验，记录空白滴定消耗盐酸的体积。,改良式定氮蒸馏器,半微量定氮蒸馏器,注意问题：加入样品不要沾附在凯氏烧瓶瓶颈；消化开始时不要用强火，要控制好热源，并注意不时转动凯氏烧瓶，以便利用冷凝酸液将附在瓶壁上的固体残渣洗下并促进其消化完全；样品中若含脂肪或糖较多，在消化前应加入少量辛醇或液体石蜡或硅油作消泡剂，以防消化过程中产生大量泡沫；,消化完全后要冷至室温才能稀释或定容。所用试剂溶液应用无氨蒸馏水配制。当样品消化液不易澄清透明时，可将凯氏烧瓶冷却，加入30过氧化氢23m1后再继续加热消化。般消化至呈透明后，继续消化30分钟即可。有机物如分解完全，消化液呈蓝色或浅绿色，但含铁量多时，呈较深绿色。,蒸馏装置不能漏气。若取样量较大，如干试样超过5g可按每克试样5mL的比例增加硫酸用量。如硫酸缺少，过多的硫酸钾会引起氨的损失，这时会形成硫酸氢钾，而不与氨作用，因此当硫酸被过多底物消耗掉或样品中脂肪含量过高时，要添加硫酸。,蒸馏前若加碱量不足，消化液呈蓝色不生成氢氧化铜沉淀，此时需再增加氢氧化钠用量。氢氧化铜在7090时发黑。蒸馏完毕后，应先将冷凝管下端提离液面清洗管口，再蒸1分钟后关掉热源否则可能造成吸收液倒吸。,X=,X为样品中蛋白质的含量g/100gV1为样品消耗盐酸标准液的体积V2为试剂空白消耗盐酸标准液的体积C为盐酸标准液的浓度M为1/2N2的摩尔质量,14.01g/molm为样品的质量F为氮换算为蛋白质的系数,结果计算,(二)微量凯氏定氮法1、原理及适用范围:同常量凯氏定氮2、与常量法不同点：加入硼酸量由50mL10mL盐酸浓度由0.1mol/L0.01mol/L蒸馏装置不同3、蒸馏装置见123页图8-2。,A蒸气发生器B汽水分离器C反应管D进样口E冷凝管F吸收瓶G玻璃珠H导管,将消化液全部转移到100mL容量瓶中,加10ml硼酸溶液和混合指示剂23d,加入NaOH溶液后颜色为深蓝色或褐色,通入蒸汽开始蒸馏,冷凝管下口浸入硼酸溶液中,取10mL消化稀释液沿小玻璃杯移入反应室，少量蒸馏水冲洗，塞紧棒状玻璃塞，向小玻璃杯内加入10mL40%NaOH,提起玻璃塞，使NaOH缓慢流入反应室，立即塞紧玻璃塞，并在小玻璃杯中加水使之密封。,加水至2/3体积处，加数滴甲基橙指示剂和硫酸几毫升，使水呈酸性,吸收液变蓝色后继续蒸馏5分钟，将冷凝管尖端提离液面再蒸馏1min，用蒸馏水冲洗冷凝管尖端，取下接收瓶，关闭电源,注意问题：（1）整套装置不能漏气，要注意各蒸汽控制夹子的操作，以防蒸汽受阻爆炸或吸收液倒吸。（2）在蒸汽发生瓶中要加入硫酸和甲基橙使呈酸性以防水中的氨蒸出。（3）蒸馏完毕后，应先将冷凝管下端提离液面，再蒸1分钟，将附着在尖端的吸收液完全洗入吸收瓶内，再将吸收瓶移开，最后关闭电源，绝不能先关闭电源，否则吸收液将发生倒吸。,（4）在每次测定前及两次测定之间，均要洗涤反应管(倒吸法，在吸收瓶中加入蒸馏水，其余同测定时的做法，在蒸汽发生器中水剧烈沸腾后，立即移开电炉，水即从吸收瓶中倒吸入反应管，再倒吸入汽水分离管或蒸汽发生器中，打开夹子，即可放出废水。,(三)自动凯氏定氮法,150160,双缩脲,双缩脲能和硫酸铜的碱性溶液生成紫红色络和物，此反应称为双缩脲反应。,一、双缩脲法,第三节蛋白质的快速分析方法,蛋白质分子中含有肽键CONH与双缩脲结构相似。在同样条件下也有呈色反应，在一定条件下，其颜色深浅与蛋白质含量成正比，可用分光光度计来测其吸光度，确定含量。（540nm）,特点：受蛋白质特异性影响小，操作简单快速，灵敏度低，所需样品量大，常用于生物化学领域。,操作方法,1、制作标准曲线,以采用凯氏定氮法测出蛋白质含量的样品作为标准蛋白质样，配制不同浓度标准样，A560为纵坐标，蛋白质浓度为横坐标，绘制标准曲线。,2、样品测定,注意事项,1.配制试剂加入硫酸铜溶液时需剧烈搅拌。2.脂肪含量高的样品应预先提取脂肪；3.样品有不溶性成分存在，可先提取蛋白质在测定4.计算结果需注明干基还是湿基5.本法已被用于谷类、肉类、大豆及动物饲料等样品的蛋白质测定。,二、紫外吸收法,（一）A280nm光吸收法,蛋白质及其降解产物的芳香环残基具有吸收紫外光的性质，最大吸收峰在280nm波长处。在此波长下，蛋白质溶液的吸光度与其浓度（3-8ug/mL）呈正比关系，可作定量测定。,（二）肽键紫外光测定法,两步反应：,(1)在碱性条件下，蛋白质(肽键）与铜离子作用生成蛋白质-铜络合物。,(2)此络合物将试剂磷钼酸-磷钨酸(olin试剂)还原，混合物深蓝色(磷钼蓝和磷钨蓝混合物)（A750)。,四、福林-酚法（双缩脲法的发展）,五、考马斯亮蓝染料比色法,考马斯亮蓝G-250是一种蛋白质染料，与蛋白质通过范德华力结合，是蛋白质染色，在620nm处有最大吸收值，可用于蛋白质的测定，适合大量样品的测定。,六、水杨酸比色法原理：样品中的蛋白质经硫酸消化而转化成铵盐溶液后，在一定的酸度和温度条件下可与水杨酸和次氯酸钠作用生成蓝色化合物，在660nm处比色测定，求出样品的含氮量，进而计算出蛋白质的含量。,七、比浊法,低浓度的三氯乙酸、磺基水杨酸和乙酸中的铁氰化钾能使提取的蛋白质沉淀，形成蛋白质颗粒的悬浊液，其浊度可通过辐射光传送过程中的衰减而确定，其衰减程度与溶液中蛋白质的浓度呈正比。主要用于小麦面粉和玉米蛋白质含量测定。,八、杜马斯法（燃烧法）,样品在高温下（700-800）燃烧，释放的氮气由带热导检测器（TCD)的气相色谱仪测定。测得的含氮量转换成样品中的蛋白质含量。,氨基酸的含量一直是某些发酵产品如调味品的质量指标，也是目前许多保健食品的质量指标之一，其中的含氮量可直接测定，不同于蛋白质的氮，故称为氨基酸态氮。氨基酸态氮反映的是样品中游离氨基酸的总量。,第六节氨基酸的定量测定,氨基酸态氮的测定,双指示剂甲醛滴定法,电位滴定法,一、氨基酸的一般定量测定方法,（一）双指示剂甲醛滴定法,原理：氨基酸具有酸性的-COOH基和碱性的-NH2基。它们相互作用而使氨基酸成为中性的内盐。当加入甲醛溶液时，-NH2基与甲醛结合，从而使其碱性消失。这样就可以用强碱标准溶液来滴定-COOH基，用间接的方法测定氨基酸的总量。,操作方法预处理：移取含氨基酸约2030mg的样品溶液2份中和游离酸（用中性红作指示剂，先测定其它游离酸的含量）：其中1份加入3滴中性红指示剂，用0.1mol/L氢氧化钠标准溶液滴定至由红变为琥珀色为终点，记录V1滴定氨态氮（用百里酚酞作指示剂测定氨基酸和游离酸的总含量）：另1份加入3滴百里酚酞指示剂及中性甲醛20mL，摇匀，静置1分钟，用0.1mol/L氢氧化钠标准溶液滴定至淡蓝色为终点，记录V2,式中c氢氧化钠标准溶液的浓度，mol/L;V1用中性红作指示剂滴定时消耗氢氧化钠标准溶液的体积，mL;V2用百里酚酞作指示剂滴定时消耗氢氧化钠标准溶液的体积，mL;m测定用样品溶液相当于样品的质量，g0.014氮的毫摩尔质量，g/mmol,结果计算,说明及注意事项,1、此法适用于测定食品中游离的氨基酸2、固体样品应先进行粉碎，准确称取后用水萃取，50水浴中萃取0.5h即可。液体样品可直接进行测定。3、若样品颜色较深，可加适量活性炭脱色后再测定，或用电位滴定法进行测定。4、与本法类似的还有单指示剂（百里酚酞）甲醛滴定法，此法用标准碱完全中和-COOH时的pH为8.59.5，但分析结果稍偏低，即双指示剂法的结果更准确。,二、电位滴定法,根据氨基的两性作用，加入甲醛以固定氨基的碱性，使羧基显示酸性，将酸度计的玻璃电极和甘汞电极同时插入被测液中构成电池，用NaOH标准溶液滴定，根据酸度计指示的pH值判断和控制滴定的终点。,pH,8.2,9.2,酸度计的使用操作规程调节开关用缓冲溶液校正pH计,清洗电极吸干电极上面的水把电极插入被测溶液中,测定清洗并擦干电极,式中W-氨基酸态氮质量浓度，%;c-氢氧化钠浓度，mol/L；V1-加入甲醛后耗NaOH的量，mL；V2-空白试验加甲醛后耗NaOH量，mL；0.014-氮的毫摩尔质量，g/mol；m-样品量，g,说明与注意事项本法准确快速，可用于各类样品游离氨基酸含量测定对于混浊和色深样液可不经处理而直接测定。结果要求精密度10%，即在重复条件下两次独立测定结果的绝对差值不超过算术平均值的10%。,（三）茚三酮比色法,氨基酸在碱性溶液中能与茚三酮作用，生成蓝紫色化合物（除脯氨酸外均有此反应）,该蓝紫色化合物的颜色深浅与氨基酸含量成正比，其最大吸收波长为570nm.,（七）乙酰丙酮和甲醛荧光法,（六）三硝基苯磺酸法,（四）非水溶液滴定法,（五）邻苯二甲醛法,二、个别氨基酸的定量测定方法,（一）赖氨酸的测定用铜离子阻碍游离氨基酸的-氨基,使赖氨酸的-氨基可以自由地与1-氟-2,4二硝基苯(FDNB)反应,生成-DNP-赖氨酸。经酸化和用二乙基醚提取,在波长390nm处有吸收峰,从而求出样品中游离赖氨酸的含量.,（二）色氨酸的测定样品中的蛋白质经碱水解后，游离的色氨酸与甲醛和含铁离子的三氯乙酸溶液作用，生成哈尔满化合物（norharman），具有特征荧光值，可以进行定量测定。,（三）苯丙氨酸的测定苯丙氨酸与茚三酮及铜盐反应生成荧光复合物，其荧光复合物在激发波长365nm，发射波长490nm处可以产生最大荧光强度，与标准氨基酸对照，可求出样品中苯丙氨酸的含量，