实验八：NADH正、负向反应测定酶的活性 - 副本

实验五,NADH正、负向反应测定酶的活性,一、NADH正向反应法测定血清LD(连续监测法),目的：1通过对LD的测定，要求掌握NADH正向反应法测定的基本原理，以及该法测定应注意的事项；2熟悉LD测定原理和注意事项及方法学评价；了解利用NADH正向反应法测定其它项目的基本原理。,原理,LD催化下述反应：L一乳酸+NAD+LD丙酮酸+NADH+H+在反应过程中，乳酸氧化生成丙酮酸，同时使NAD+还原为NADH。NADH在340nm处有吸收峰，因此反应会引起340nm吸光度的增高，并且吸光度增加的速率与样本中LD的酶活性成正比。,试剂,1Tris一乳酸锂缓冲液(含Tris100mmol/L，乳酸锂55mmolL):2底物应用液(含Tris100mmolL，NAD8.5mmolL),操作步骤,1标本要求：血清或肝素抗凝血浆2主要参数：孵育时间：120s连续检测时间：120s温度：37,5min,S:4lR1:200l,R2:50l,340/405nm,结果计算,式中Amin：平均每分钟吸光度增加值6220：340nm处NADH的摩尔吸光系数V(1.05)：比色液总体积(m1)v(0.05)：血清用量(m1)L:1cm比色光径。参考范围:成人109245UL。,注意事项,1LD活性测定也可用抗凝血浆，但不同抗凝剂对LD测定的影响不同：草酸盐抗凝剂、EDTA能抑制LD活性，而肝素的影响不大。2不同的LD同工酶对温度的敏感性是不同的，组织提取液若放于一20过夜，LD4和LD5会丧失全部的活性。血清标本应存放于室温下，一般23天不会出现活性的丢失。如果血清标本需要存放较长时间，应加入10mgml的NAD+或31/ml的谷胱甘肽后于4保存。3LD活性能被巯基试剂所抑制，另外硼酸、丙二酸、草酸以及EDTA都是竞争性抑制剂。4由于红细胞、血小板中含有大量的LD，故严禁使用溶血标本。在采用血浆作为标本时必须用3000rmin离心15min以除去血小板。,方法学评价,乳酸脱氢酶(Lactatedehydrogenase，LD)是糖酵解和糖异生中的一个重要酶，含有锌离子，广泛分布于人和动物组织、植物和微生物中，能可逆地催化乳酸(L)和丙酮酸(P)之间的氧化还原反应。其中LP为正向反应，PL为逆向反应。正反两向反应的最适pH不同，其中正向反应最适pH为8.89.8，偏碱，能使平衡偏向生成丙酮酸的方向。其优点是乳酸和NAD+稳定性好，且NAD+纯品易得、价格较低，过量乳酸对LD活性的抑制较小，反应线性较好。缺点是需要较高的底物浓度，反应速度较慢。LD活性测定时正向反应和逆向反应都可以运用，但1996年中华医学会检验学会酶学组专家推荐选择正向反应,方法学评价,本实验是根据正向反应(LP)建立的连续监测法，其优点在于：乳酸盐与NAD+底物溶液的稳定性较好，冰冻放置可稳定6个月以上。且两溶液的浓度对测定方法的影响最小，NAD+较少被产物抑制。反应的线性范围较宽(726U/L)，重复性较好，精密度较高(LD为65U/L时日间CV为5.8，LD为149U/L时日间CV为3.2)特异性高(血清中存在的非LD的其他NAD+类氧化还原酶的内源性底物少，加上样本被高度稀释，故这些酶的干扰作用可忽略不计)。,思考题,1NADH正向反应法测定的基本原理是什么?请列举出应用NADH正向反应法测定其他生化检验项目的原理?2LD的测定为什么推荐采用LP正向反应法?该反应存在哪些缺点?3LD的测定的血清标本，在处理和保存中应注意哪些事项?,二、NADH负向反应法测定血清ALT(连续监测法),目的:通过对ALT测定，要求掌握NADH负向反应法测定的基本原理，以及该法测定应注意的事项；掌握单、双试剂测定ALT的原理和方法；熟悉ALT连续监测法测定的优缺点和方法学评价；了解利用NADH负向反应法测定其他项目的基本原理。,原理,L-丙氨酸+-酮戊二酸ALT-丙酮酸+L-谷氨酸-丙酮酸+NADHLDH乳酸+NAD+连续监测法测定NADH被氧化为NAD+可在340nm连续监测到NADH的消耗量，从而计算出ALT活性浓度ALT双试剂法测定中，首先使血清与缺少-酮戊二酸的、底物溶液混合，37保温5min，将样品中所含的-酮酸(如丙酮酸)消耗完，然后，加入-酮戊二酸启动ALT催化的反应，在波长340nm处连续监测吸光度下降速率。根据线性反应期吸光度下降速率(-A/min)，来计算ALT的活性浓度。,操作步骤,1标本要求：血清或肝素抗凝血浆2主要参数：孵育时间：90s连续检测时间：150s温度：37,5min,S:20lR1:200l,R2:50l,340/405nm,结果计算,式中6220为NADH在340nm的摩尔吸光系数。参考范围540UL。,注意事项,1使用连续监测法测定酶的活性时，要求使用的分光光度计，比色杯光径1.0cm，具有(370.1)的恒温装置。由于试剂空白的读数来自工具酶中的杂酶及NADH自发氧化。在报告结果时应扣除每批试剂的空白测定值。2血清不宜反复冰冻保存，以免影响酶活性。血清置4冰箱1周，酶活性无显著变化，不推荐冰冻保存ALT测定标本，而宜用新鲜血清标本。草酸盐、肝素、枸橼酸盐虽不抑制酶活性，但可引起反应液轻度混浊。血液混浊时可影响测定结果或无法测定(如血脂过高、血清蛋白变质等)。红细胞内ALT含量为血清中35倍，应避免使用溶血标本。3正常新生儿ALT水平比成年人约高2倍，出生后约3个月降至成人水平。,方法学评价,1ALT测定中存在着两个副反应(1)血清中存在的-酮酸(如丙酮酸)能消耗NADH。丙酮酸+NADHLDH乳酸+NAD+(2)血清中谷氨酸脱氢酶(GLDH)增高时，在有氨存在条件下，亦能消耗NADH.NH4+-酮戊二酸+NADHGLDH谷氨酸+NAD+CO2上述副反应都能消耗NADH,使340nm处吸光度下降值(-Amin)增加，使测定结果偏高。但在双试剂法，因温育期长，能有效地消除干扰反应，测定准确性高，因而是ALT测定的首选方法。双试剂法还可适当降低试剂中的LD的用量。至于NH4+的干扰，除严重肝病时血清谷氨酸脱氢酶活性增高和血氨增高外，一般血清中NH4+的含量甚微，此干扰反应不大。,方法学评价,2在AACC(美国临床化学学会)或IFCC(国际临床化学学会)推荐的试剂盒中，含有磷酸吡哆醛(P一5一P)，在某些病理状态下，血清中存在脱辅基的ALT酶蛋白，当使用含P一5一P的底物时可使血清ALT活性提高755。变化的大小与血清中原有P一5一P含量有关，健康人血清中P一5一P水平偏低，底物中P一5一P可显著升高ALT活性。根据我国的实际情况和习惯,国家卫生部临床检验中心的推荐方法试剂中不加P一5一P。,方法学评价,3在ALT测定中，有的用磷酸盐缓冲液，有的用Tris缓冲液，有文献报告：NADH在Tris缓冲液中稳定性较高；P-5-P在Tris缓冲液中却能显示更有效的激活作用；4本法由于测定上限在酶促反应的线性范围内，偏差小，准确性好；测定条件较赖氏法易于控制，CV值比赖氏法小，精确性好；标本测定中不需要标准对照，测定结果计算方便，操作简便。但实验条件要求严格，成本高。,思考题,1NADH负向反应法测定的基本原理是什么?请列举出应用NADH负向反应法测定其他