第三章酶的发酵生产ppt课件

.,第三章酶的来源与发酵生产,.,1.酶的来源2.优良产酶菌的筛选3.微生物酶的发酵生产基本要求：掌握微生物酶的发酵生产培养基及发酵方式的选择和体系的控制，熟悉优良产酶菌的筛选原则。,.,第一节酶的来源,.,.,一、酶的来源,1.主要来源于生物：所有细胞都有产酶的能力，但不是所有细胞都是酶的合适来源动物：胰脏胰蛋白酶，胃粘膜胃蛋白酶植物：菠萝、木瓜蛋白酶微生物：利用微生物细胞的生命活动合成所需酶类的方法称为发酵法,.,为什么要利用微生物？,抗生素、氨基酸、酶制剂等产品为什么能通过微生物发酵来生产？这与微生物的生长和代谢特点有什么关系？1、某些微生物因争夺生存环境或营养物，会产生抗生素将其他种类的微生物杀死。2、微生物会产生蛋白酶、纤维素酶和淀粉酶，将营养物质水解成可吸收的小分子的多肽或氨基酸、葡萄糖。3、微生物细胞会通过合成或分解代谢生产它必需的一些物质，包括氨基酸、核苷酸等。,.,微生物作为酶来源的优越性：,1）种类繁多（20万种）2）易于人工控制，获得高产酶的菌种3）微生物生长周期短，繁殖迅速，培养方便，成本低4）提高微生物产酶的途径多5）培养条件简单，易于自动化，生产易管理6）微生物本身也容易改造,.,2.人工合成酶制剂：,蛋白质的人工合成：人工合成胰岛素等人工合成酶制剂受客观条件的限制，如试剂、设备等，另外，体外合成，形成单体的难度大，且只能合成那些已经完全搞清楚其化学结构的酶类。,钮经义（1920-1995),.,目前，应用于工业的酶类，主要来自于微生物发酵。,.,什么是发酵？,利用微生物，在适宜的条件下，将原料经过特定的代谢途径转化为人类所需要的产物的过程。,.,发酵工业经历了哪几个阶段？,原始发展阶段（发酵技术原始，顶多是家庭小制作，技术进步缓慢，完全是经验式的，并不知道其中的原理。）传统发酵工业阶段（人们才开始了解发酵现象的本质，采用开放式的发酵方式，生产过程较为简单，对生产设备要求不高，规模一般不大。）现代发酵工业阶段（生产技术要求高；生产规模大；技术发展速度快；菌种的生产能力大幅度提高，新产品、新技术、新设备的应用达到前所未有的程度。）生物技术产业阶段（利用构建的基因工程菌生产）,.,发酵工程,.,二、酶的生物合成,Centraldogma,酶合成的基本过程,转录翻译调控,.,基因表达的调控,染色质活化,转录起始、延长、终止转录后加工,基因表达在全过程的各水平上都可以受调控：,转录起始调节是基因表达调控的主要环节,.,蛋白质因子,特异DNA序列,.,.,乳糖操纵子诱导型操纵子,乳糖操纵子的结构,.,没有乳糖存在时,乳糖操纵子被阻遏蛋白封闭,.,有乳糖存在时,乳糖操纵子被诱导物开放,.,无葡萄糖，cAMP浓度高时,有葡萄糖，cAMP浓度低时,CAP,CAP结合位点,.,低半乳糖时,高半乳糖时,葡萄糖低cAMP浓度高,葡萄糖高cAMP浓度低,无转录,无转录,低水平转录,.,.,Trp高时,Trp低时,mRNA,O,P,trpR,调节区,结构基因,RNA聚合酶,RNA聚合酶,色氨酸操纵子阻遏型操纵子,操纵子关闭,.,前导序列,第10、11密码子为trp密码子,14aa前导肽编码区:,包含序列1,形成发夹结构能力强弱：序列1/2序列2/3序列3/4,.,UUUU3,前导肽,前导mRNA,当色氨酸浓度高时,转录衰减机制,衰减子结构就是终止子可使转录,RNA聚合酶,终止,.,前导肽,RNA聚合酶,当色氨酸浓度低时,Trp合成酶系相关结构基因被转录,序列3、4不能形成衰减子结构,前导mRNA,.,细胞周期与酶的合成,可能的三种模式：合成伴着生长进行，进入静止期，合成降低对数生长期合成降低，静止期合成增加中间类型,.,三、酶发酵动力学,主要研究在发酵过程中细胞生长速率，产物形成速率以及环境因素对速率的影响.在酶的发酵生产中,研究酶发酵动力学对于了解酶生物合成模式；发酵条件的优化控制,提高酶产量具有重要的理论指导意义。,.,影响酶生物合成模式的因素主要是:mRNA和培养基中存在的阻遏物：mRNA稳定性高的，在细胞停止生长后继续合成相应的酶；mRNA稳定性差的，随着细胞生长停止而终止酶的合成；不受阻遏物阻遏的,可随着细胞生长而开始酶的合成；受阻遏物阻遏的,要在细胞生长一段时间或进入稳定期后解除阻遏,才能开始酶的合成。,.,酶生物合成模式：根据酶的合成与细胞生长的关系，可以把酶生物合成模式分为4种类型：同步合成型延续合成型中期合成型滞后合成型。,.,同步合成型：,又称生长偶联型,是指酶合成与细胞生长同步进行，当细胞生长进入对数期时，酶也大量合成；当细胞进入稳定期时,酶的合成也停止。,大部分大组成型酶及部分诱导酶.mRNA不稳定,细胞进入生长平衡期后,新的mRNA不再合成.,.,.,延续合成型：,酶的合成伴随着细胞生长而开始，但在细胞生长进入稳定期后,酶的合成仍将延续较长一段时间。生物合成可受诱导物诱导,一般不受分解代谢物阻遏mRNA相当稳定,.,.,中期合成型：,酶的合成在细胞生长一段时间后才开始，而在细胞生长进入稳定期后,酶的合成也终止。酶的生物合成受到产物的反馈阻遏作用或分解代谢物阻遏,酶的mRNA稳定性差.,.,.,滞后合成型：,只有当细胞生长进入稳定期后才开始酶的合成并大量积累培养基中含阻遏物,mRNA稳定性好,如果去除阻遏物,则为延续合成型.,.,浓度,时间(h),细胞浓度,酶浓度,细胞浓度,酶浓度,酶浓度,酶浓度,细胞浓度,细胞浓度,图3-1酶生物合成模式A.同步合成型;B.延续合成型;C.中期合成型;D.滞后合成型,A,B,C,D,.,在酶的工业生产中，为了提高酶产率和缩短发酵周期,最理想的酶合成模式是延续合成型；对于其它类型的酶,要在菌种选育和工艺条件上加以调节；对于同步合成型，尽量提高mRNA的稳定性，如降低发酵温度;对于滞后合成型,尽量减少阻遏物；对于中期合成型，要从提高mRNA稳定性和解除阻遏两方面进行。,.,三、优良产酶菌的筛选,（一）必备条件：1.安全可靠，无毒性，不是致病菌：微生物及其代谢产物安全无毒，对人体和环境都无不良影响，对酶的应用也无不良影响。2.酶的产量高：要有高产的特性，通常，生长周期短。高产细胞可通过多次反复筛选，诱变或采用基因克隆、细胞或者原生质体融合等技术获得，在生产过程中，要注意，若其发生退化，要经复壮处理,.,3.容易培养和管理：优良的产酶菌对培养基和工艺条件没有特别苛刻的要求。4.产酶稳定性好:优良的产酶细胞在正常条件下，能够稳定生长和产酶，不易受噬菌体侵袭，不易变异退化，一旦发生退化，经复壮处理，可恢复其产酶特性。5.有利于酶的分离纯化：以便获得高纯度的酶，满足使用者的需求。,.,一般生产菌株可向菌种保藏机构或生产部门索取自然界分离：菌样采集菌种分离粗筛纯化复筛生产性能鉴定实验室改良基因突变基因转移基因克隆,四、产酶微生物的筛选,.,A、从微生物发生和存在的环境中采集土壤降解酶类易从其底物富集场所获得（纤维素酶易从森林土壤和木材堆放处获得）耐热酶易从高温处（如温泉、火山口）获得,1.菌样采集,B、系统发生相近的物种，其产酶性质相似不同蛋白酶性质不同，但霉菌的蛋白酶性质相似，不同于细菌蛋白酶C、胞外酶活性显现的最适条件和稳定条件与产酶菌的生长条件相一致,.,2.菌种的分离纯化：平板划线法稀释法等等,.,3.筛选,平板培养透明圈法：适合于水解酶类。将合适底物溶于固体培养基中，观察透明圈的情况。改变培养基条件，看透明圈变化情况，即可调节最佳培养条件胞内酶：固体或液体培养，收集酶液，进行活性测定筛选时，还要注意菌种生长传代情况及保存时间对酶活的影响情况,.,4.实验室改良遗传学在酶学的应用,基因突变：在物理、化学等因素作用下，DNA发生损伤或者畸变损伤的位点可在结构基因上，也可在顺式作用元件上基因突变的方向不确定，需要大工作量的筛选过程基因转移：转化或者转导基因扩增基因克隆：,.,四、常见的产酶微生物,大肠杆菌：枯草芽孢杆菌黑曲霉米曲霉青霉木霉,.,根霉毛霉红曲霉链霉菌啤酒酵母假丝酵母,.,.,.,.,.,第二节发酵工艺条件及控制,酶的发酵生产：利用微生物的生命活动获得所需的酶的技术过程。,.,一、酶的发酵生产类型:,根据微生物培养方式的不同可分为：固体发酵液体发酵载体发酵,.,（一）固体发酵(传统）,其培养基以麸皮、米糠等为主要原料，加入其它必要的营养成分，制成固体或半固体麸曲，经过灭菌、冷却后，接种产酶微生物应用：我国传统的各种酒曲、酱油曲，所以又称为曲法培养适合霉菌生产：菌丝体生长好，产酶量高,.,主要生产淀粉酶和蛋白酶优点：设备简单，操作方便，麸曲中酶浓度较高，特别适合于各种霉菌的培养和发酵产酶。缺点：劳动强度大，原料利用率低，生长周期长,.,（二）液体发酵法,采用液体培养基，置于生物反应器中，经灭菌、冷却后接种产酶细胞，在一定条件下发酵。机械化程度较高，是目前酶发酵生产的主要方式。,.,优点：适应性强，可用于各种细胞（动物、植物、微生物）的悬浮培养和发酵易于人为控制机械化程度高，酶产品质量好，酶产率及产品回收率较高适合大规模生产缺点：需要一定的设备和技术条件能耗大要防止杂菌污染,.,1.间歇发酵,适用于延续合成型又称为二次发酵。生长的最适条件产酶的最适条件如：灰色链霉菌：加富培养基17hr收集菌体，并洗涤稀盐溶液诱导物（酵母-聚甘露糖）18-24hr,生产方式:,.,2.连续发酵,适用于同步合成型先将菌体培养到对数生长期，然后一边添加新鲜培养基，一边收集培养物，使之平衡或：分批投料并加种子劳动效率提高抑制反馈阻遏,.,（三）载体发酵：,其特点是以天然的或者人工合成的多孔材料为载体，并以合成的液体培养基代替麸皮之类的固体而培养微生物，这种固定化技术，是在固定化酶的基础上建立起来的固定化细胞发酵固定化原生质技术：,.,二、生产工艺,活化：使用以前，必须接种于新鲜的斜面培养基上，在一定条件下进行培养，以恢复细胞的生命活动能力。扩大培养：增加发酵时的数量，经过一级至数级扩大培养。培养基称为种子培养基。,（一）细胞活化与扩大培养,.,（二）培养基的配制,培养基的营养成分（1）碳源（2）氮源（3）无机盐（4）生长因子（5）水（6）酶的诱导剂和促进剂有时，细胞在生长、繁殖和发酵过程中需要采用不同的培养基,.,生长因子：某些微生物本身不能从普通的碳源、氮源合成，需要额外少量加入才能满足需要的有机物质，包括氨基酸、维生素、嘌呤、嘧啶及其衍生物，有时也包括一些脂肪酸及其他膜成分,.,发酵培养基的配制原则,营养物质应满足微生物的需要。不同营养类型的微生物对营养的需求差异很大，应根据菌种对各营养要素的不同要求进行配制。营养物的浓度及配比应恰当。营养物浓度太低，不能满足微生物生长的需要；浓度太高，又会抑制微生物生长。物理、化学条件适宜。（pH、水活度、渗透压）在设计培养基时，必须考虑是要培养菌体，还是要积累菌体代谢产物；是实验室培养，还是大规模发酵等问题。,.,作用：建造微生物细胞的材料为生命活动提供能量构成酶的成分作为多种诱导酶的诱导物,1.碳源：为细胞提供碳架和能量来源,.,.,1）要满足不同细胞的营养要求：多数利用淀粉及其水解产物糊精、麦芽糖、葡萄糖等如：黑曲霉(它有淀粉酶系)酵母利用蔗糖或葡萄糖等，不能利用淀粉。有些微生物利用脂肪、石油、乙醇等为碳源。,使用原则：,.,2）有的菌种利用特殊的碳源才产酶：黄青霉（葡萄糖氧化酶产生菌）：甜菜糖蜜生长旺盛，但是不产酶蔗糖产酶量高短乳杆菌：（葡萄糖异构酶产生菌）：葡萄糖生长旺盛木糖产酶,.,3）同种菌，在不同浓度的有效碳源作用下，产酶量不同：可能与碳氮比有关4）碳源类型不同，还会影响到胞内酶和胞外酶的产量黄灰链霉菌：黑麦硫酸水解液36hr：胞内酶生产高峰72hr：胞外酶才开始生产,.,5）某些碳源对酶的生物合成有代谢调节作用这主要包括酶生物合成的诱导作用分解代谢物阻遏作用：,.,诱导作用：有些酶，在培养基中不存在诱导物质时，酶的合成受到阻遏，而当有底物或者其类似物或产物存在时，会诱导相应酶类的合成如：白地霉的脂肪酶合成需要培养基中加入少量橄榄油作为诱导物,.,发生在生长于易利用的碳源（如葡萄糖、甘油等）中的大多数微生物。如：淀粉（诱导）-淀粉酶果糖（抑制）乳糖(诱导)-半乳糖苷酶葡萄糖(抑制)（分解代谢物阻遏作用）,分解代谢物阻遏：某些物质（主要指葡萄糖等容易被利用的碳源和氮源等）分解代谢的产物阻遏某些酶（主要是诱导酶）生物合成的现象。,.,2.氮源构成细胞或代谢产物中氮素的来源,分类：有机氮源：各种蛋白质及其水解产物，如酪蛋白、豆饼粉、蛋白胨、牛肉膏等无机氮源：各种含氮的化合物，如：氨水、硫酸铵、磷酸铵、硝酸钾等铵盐或硝酸盐，两种盐的比例对细胞生长和新陈代谢有显著影响,.,不同细胞对氮源有不同要求：动物细胞要求有机氮源植物细胞要求无机氮源微生物：要求不同，异养型细胞要求有机氮源，自养型细胞要求无机氮源；生长和产酶所需氮源会有不同。,.,碳氮比（C/N）：培养基中碳元素的总量与氮元素的总量之比，不同培养基该值不同，且相差很大，对酶产量有显著影响.例如,较低的碳氮比（C/N）常有利于蛋白酶产量的提高,但是这种条件下,发酵后期培养基的pH值往往会向碱侧偏移,反过来又会阻遏蛋白酶的积累.因此选择并控制适宜的碳氮比也是提高酶产量的一个重要因素.,.,氮调节作用：由于氨基酸或氨的充分供应，而引起的与氮代谢有关、特别是与那些供应氨或谷氨酸有关的酶的阻遏，称为氮的分解代谢物阻遏，又称为氮调节作用,.,3.无机盐类：,是提供细胞生命活动不可缺的无机元素，并对细胞内外的pH值、氧化还原电位和渗透压起调节作用，有时可作为某些微生物生长的能源物质按需用量分类：大量元素：S、P、K、Na、Ca、Mg、Cl等微量元素：Cu、Mn、Zn、Co、Br、I等（必不可少，但过量对生命活动有不良影响,.,不同无机元素在生物活动中作用不同：组成细胞的主要元素：S、P等组成酶分子的主要元素：S、P、Zn、Ca等作为酶的激活剂：K、Mg、Zn、Cu、Fe、Br、I等调节pH、氧化还原电位、渗透压等：K、Na、Ca、ClS和P的含量也会对微生物的酶合成有调节作用，主要调控方式也是阻遏调控。,.,4.生长因子（素）：,生长繁殖过程中必需的微量有机化合物，包括各种氨基酸（组成蛋白质）、嘌呤、嘧啶（组成核酸、辅基、辅酶）、维生素和生长激素（调节细胞生长分裂），这些对于营养缺陷型微生物更必需）通常在酶的发酵过程中，一般培养基中加入含各种生长激素的天然原料的水解物，如酵母膏、玉米浆和麦芽汁等,.,5.水水质的影响6.诱导物和促进物,.,.,.,（三）发酵条件的控制,1、温度调节：2、pH值调节：3、溶解氧的调节控制：提高溶氧速率：通气量、氧的分压、气液接触时间和面积，培养液的性质。,.,1.温度：生长繁殖、发酵产酶都需要一定的温度条件,1）不同细胞有各自不同的最适生长温度如：枯草杆菌：34-37黑曲霉：28-322）生长繁殖的最适温度和发酵产酶的最适温度不同通常情况：T（发酵产酶）T（生长繁殖）也有相同温度，或者产酶温度高的情况,.,相对较低温度条件，可提高mRNA的稳定性，延长酶合成的时间，从而合成酶量，酱油曲霉生产蛋白酶，28时的产量是40时的24倍。但是温度如果过低，但是细胞生长速度减慢，代谢速度慢，从而使得产量反而下降。所以，需要确定最适温度，对于有些情况，需要设定两个最适（最适生长温度，最适产酶温度），同时，要考虑其他因素对温度的影响，如培养基的散热过程和代谢放能过程,.,2.pH值-缓冲剂或者酸、碱,1）不同细胞，其生长繁殖的最适pH不同：一般细菌和放线菌：中性或碱性（pH6.5-8.0）霉菌和酵母：偏酸性（pH4-6）,.,2）细胞发酵产酶的最适pH与生长的最适pH常不同：细胞产酶的最适pH通常接近于该酶催化反应的最适pH。碱性磷酸酶：pH8.5-9.0酸性蛋白酶：pH4-63）但是，由于有些pH条件不适合细胞生长，所以，产酶的最适pH与催化pH不同，枯草杆菌生产碱性磷酸酶，最适催化pH为9.5，而最适产酶pH为7.4,.,4）生产过程中应对pH进行调节：细胞生长繁殖和代谢物的堆积会改变培养基的pH，在生产各阶段要合理调节：高糖培养基，由于糖代谢产生的有机酸，pH易降低含高蛋白的培养基，胺类的产生，使得pH升高,.,5）对于可产生多种酶产物的细胞，控制pH可控制酶的产量比例黑曲霉：培养基为中性产物以-淀粉酶为主酸性产物以糖化酶为主米曲霉：培养基为碱性产物主要为碱性蛋白酶中性产物主要为中性蛋白酶酸性产物主要为酸性蛋白酶,.,3.溶解氧（通气与搅拌）,细胞生长繁殖和酶合成过程都需要大量的氧气，在培养基中的细胞一般只能吸收和利用溶解氧，溶解氧指的是溶解在培养基中氧气，在发酵过程中需要不断的向培养基中供氧（无菌空气）以保持氧分压：由于氧是难溶于水的气体，培养基中少量的溶解氧，且不断被消耗细胞的产热作用，导致氧溶解度更低,.,调节溶解氧的方法主要有：调节通气量调节氧分压调节气液接触时间调节气液接触面积改变培养液的性质,.,具体方法：通气和搅拌,通气：增加氧气量搅拌：打碎气泡增加表面积，加速氧向液相传递，并且加速液体流动，以延缓气泡上升至液面逸出过程但是，避免剧烈搅拌，以防产生大量泡沫，阻碍CO2的排除，并防止发酵液溢出，以防污染,.,注意：溶氧速率不宜太高，要控制溶氧速率，是因为：1）过高的溶氧，造成浪费，2）高溶氧速率会抑制某些酶的生物合成，如青霉素酰化酶，3）为获得高溶氧而采用的大量通气或快速搅拌，会使得某些细胞（如霉菌、放线菌、固定化细胞等）受到损伤,.,四、提高酶产量的措施,酶合成的调节机制：在正常情况下，酶产量受酶合成调节机制的控制，要提高酶产量必须打破这种调节控制。酶合成主要取决于转录水平的调节，原核生物中普遍公认的调节机制是操纵子理论。,.,措施：,添加诱导物降低阻遏物浓度添加表面活性剂添加产酶促进剂,.,（一）添加诱导物,对于某些诱导酶的发酵生产，在合适的时候添加合适的诱导物，可以增加酶的产量一般来说，不同的酶有各自不同的诱导物，有时一种诱导物可以诱导同种酶系的若干种酶