《杂交水稻的扩增》PPT课件

杂交水稻种子纯度的鉴定,RAPD扩增,传统的种子纯度鉴定主要有田间鉴定法和实验室鉴定法。实验室鉴定种子纯度主要依据种子的物理、化学及生理特性等。但随着生物化学及分子生物学技术的迅速发展，种子纯度鉴定技术产生了质的飞跃，现代生物化学和分子生物学技术被成功地引入到种子纯度的鉴定中，如分子标记等。,分子标记是指以生物大分子的多态性为基础的遗传标记。广义的分子标记包括同工酶标记和DNA标记狭义的分子标记仅指DNA标记DNA标记主要有：,RFLP(RestrictionFragmentLengthPolymorphism即限制性片断长度多态性)它是由于核酸序列不同而造成的DNA限制性片断之间产生等位基因差异的结果。2.RAPD(RandomAmplifiedPolymorphicDNA，随机扩增多态性DNA)。3.AFLP(AmplifiedFragmentLengthPolymorphism，扩增片段的长度多态性)。4.SAP(SpecificAmplifiedPolymorphism,特异性扩增长度多态性)。,RAPD(RandomAmplifiedPolymorphicDNA，随机扩增多态性DNA)是1990年由美国科学家J.G.K.Williams和加利福尼亚生物研究所J.Welsh领导的两个小组几乎同时发展起来的一种DNA指纹技术，它是以DNA为模板，以一个随机的寡聚核苷酸序列(10个碱基)为引物，通过PCR扩增，产生分子量大小不连续的DNA片段，通过琼脂糖凝胶电泳来检测DNA多态性,一般讲,通过PCR扩增产生的不连续的几个DNA产物,往往是由于不同的遗传位点而产生,多态性的产生是由于突变或重排而造成的,这些变化可以发生在引物结合位点上,也可以位于引物结合序列之间。,RAPD用用于杂交水稻种子纯度鉴定的工作原理,DNA多态性是指DNA碱基顺序的差异性。这种差异性不仅存在于不同的植物之间，也存在于同一种植物的不同个体之间。,它们的基因组DNA限制性内切酶位点的种类和数目不同，用各自DNA为模板，以一个随机的寡聚核苷酸序列(10个碱基)为引物，通过PCR扩增，产生分子量大小不连续的DNA片段，通过琼脂糖凝胶电泳分离和溴化乙锭染色，在紫外检测仪下观察，即可直接看到这种差异,RAPD技术操作过程：,一、材料杂交水稻的DNA(50ng/ul)。二、设备PCR仪，PCR管或硅化的0.5mleppendorf管，电泳装置。,三、试剂1、随机引物(10mer)(5umol/L)：购买成品。2、Taq酶：购买成品。3、10 xPCR缓冲液。4、MgCl2：25mmol/L。5、dNTP：每种2.5mmol/L,四、操作步骤：1.在25ul反应体系中,加入模板DNA1ul(50ng)随机引物1ul(约5pmol)10 xPCRBuffer2.5ulMgCl22uldNTP2ulTaq酶1单位（U）加ddH2O至25ul混匀稍离心,加一滴矿物油。,2.在加热至90以上的PCR仪中预变性942分钟,然后循环:941分钟，361分钟，721分钟，共35轮循环。3.循环结束后,7210分钟，4保存。4.取PCR产物15ul加3ul上样缓冲液(6x)于2%琼脂糖胶上电泳,稳压50-100V（电压低带型整齐，分辨率高）。5.电泳结束，观察、拍照。,PCR(聚合酶链式反应)，即通过引物延伸核酸的某个区域而进行的重复双向DNA合成。PCR循环过程有三种不同的事件发生：1.模板变性（92-96）；2.引物退火（37-65）；3.热稳定DNA聚合酶进行DNA合成-延伸（72）。,变性、退火、延伸的循环过程-PCR扩增。在第二个循环中，新链作为模板参与反应，每完成一个循环将使目的DNA扩增一倍，25-35个循环后，目的DNA将达到106倍。琼脂糖电泳、EB染色即可得到DNA指纹图谱。,注意事项1、电泳时一般RAPD带有5-15条,大小0.1-2.0kb。2、特异性的DNA带可以克隆作为一个新的分子标记应用。,RAPD技术的优点,不使用同位素，减少了对工作人员健康的危害；可以在物种没有任何分子生物学研究的情况下分析其DNA多态性；对模板DNA的纯度要求不高；,技术简单，无需克隆DNA探针，无需进行分子杂交；灵敏度高，可提供丰富的多态性；RAPD引物没有严格的种属界限，同一套引物可以应用于任何一种生物的研究，因而具有广泛性、通用性。,但是，RAPD技术较易受到各种因素的影响。无论是模板的质量和浓度，短的引物序列，PCR的循环次数，基因组DNA的复杂性，技术设备等，都有可能是RAPD技术重复性差的直接原因。,目前，多从以下几个方面来