MS-联用仪器及应用(3).ppt

2020/5/16,1,一、概述generalization,质谱：纯物质结构分析色谱：化合物分离色谱-质谱联用：共同优点GC-MS；LC-MS；CZE-MS（毛细管电泳-质谱）困难点：载气(或流动液)的分离；出峰时间监测；仪器小型化；关键点：接口技术(分子分离器),2020/5/16,2,二、GC-MS联用仪器hyphenatedtechnologyofGC-MS,2020/5/16,3,GC-MS中的分子分离器,分子分离器类型：微孔玻璃式、半透膜式和喷射式三种。喷射式分子分离器：由一对同轴收缩型喷嘴构成，喷嘴被封在一真空室中，如图所示。可做成多级。,2020/5/16,4,四极杆质量分析器（QuadrupoleMassFilter）,2020/5/16,5,仪器结构,色谱-四极杆质谱仪结构示意图,2020/5/16,6,四极杆质量分离器,2020/5/16,7,仪器与结构,2020/5/16,8,飞行时间质量分析器,2020/5/16,9,三、LC-MS联用仪器hyphenatedtechnologyofLC-MS,1.大气压电离技术（API）（1）电喷雾电离（APIElectrospray）,2020/5/16,10,Electrospray，API,电喷雾电离,流出液在高电场下形成带电喷雾，在电场力作用下穿过气帘；气帘的作用：雾化；蒸发溶剂；阻止中性溶剂分子,2020/5/16,11,Electrospray，API,电喷雾电离,电喷雾产生多电荷离子，相对分子质量Mr计算：选相邻峰，电荷n，n+1m1=(Mr+n)/2m2=(Mr+n+1)/(n+1),计算结果如表。不适用于非极性化合物,2020/5/16,12,（2）大气压化学电离（APCI）,热喷雾(100-120C)，化学电离;适用于热稳定化合物分析,2020/5/16,13,大气压化学电离（APCI）,2020/5/16,14,2.离子阱质量分析器,特定m/z离子在阱内一定轨道上稳定旋转，改变端电极电压，不同m/z离子飞出阱到达检测器；,2020/5/16,15,3.LC-MS(离子阱)联用仪器结构示意图,2020/5/16,16,4.LC-MS(四极杆)联用仪器结构示意图,2020/5/16,17,十、联用技术,a).LC/ESI-MS,1).HPLC/ESI-MS,2020/5/16,18,b).FPLC/HPLC/ESI-MS,2020/5/16,19,c).浓缩装置与ESI-MS联用,2020/5/16,20,d).流速与检测器的性质,2020/5/16,21,e).注意事项,采用挥发性缓冲液，如醋酸铵、甲酸铵、醋酸、三氟乙酸(TFA)、七氟丁酸(HFBA)等代替硼酸盐、磷酸盐和硫酸盐等；pH值应保持相同；应采用挥发性的离子对试剂。但应注意更换离子对试剂后保留时间的变化；LC用的有机溶剂应与离子化方式一致。反相LC用的极性溶剂与ESI相匹配；正相LC用的非极性溶剂与APCI相匹配；,2020/5/16,22,2).CE/ESI-MS,a).示意图,2020/5/16,23,b).SheathliquidpH的影响,2020/5/16,24,c).注意事项,Sheathliquid的成份通常为甲醇、甲氧基甲醇、乙腈并含1020%甲酸、乙酸或水；Sheathliquid流速及pH大小。流速一般为25L/min；缓冲液应为挥发性溶剂，如：乙酸、乙酸铵、碳酸铵和甲酸。缓冲液的纯度应较高，以减少背景噪音。降低待测成分的流速，以提高灵敏度。注意毛细管内径对灵敏度的影响。20mi.d.,2020/5/16,25,十一、样品的制备,超滤。采用不同截止分子量的滤膜过滤。溶剂提取。将待测成分自水相提取至有机相是常用的方法之一。这种方法的优点是应用广泛；溶剂、pH、离子对试剂等均可选择，以利提取；可浓集待测成分。缺点是耗时，有时回收率较低。固相提取。主要是使用C18、C8、C4萃取小柱。具体方法可参考公司说明书。色谱柱纯化。,2020/5/16,26,串联质谱技术(MSn),1).碰撞诱导解离(collisional-induceddissociation,CID)技术在离子阱(iontrap)、triplestagequadrupole、FTICR、磁质谱仪及混合的串联质谱仪上可实现CID反应。,a).由母离子寻找子离子(parentionstodaughterions),2020/5/16,27,b).由子离子寻找母离子(daughterionstoparentions),2020/5/16,28,c).中性丢失(neutralloss),2020/5/16,29,).CID技术在肽测序方面的应用,含有Nterminal碎片离子称为：a,borc；含有Cterminal的碎片离子称为：x,yorz.,Denovo蛋白质测序,2020/5/16,30,肽CID碎裂反应中出现的重排离子,2020/5/16,31,2020/5/16,32,2020/5/16,33,低能(LowEnergy)CID特点:反应发生在四极杆分析器和离子阱分析器；质谱图中出现Nterminal碎片离子：a,borc和有Cterminal的碎片离子：x,yorz.但主要是形成a,b和y系列离子。在碎裂过程中易丢失中性小分子NH3和H2O，分别形成a*,b*和y*和ao,bo和yo。高能(highEnergy)CID特点:反应发生在磁质谱分析器和飞行时间分析器；质谱图中出现Nterminal碎片离子：a,borc和有Cterminal的碎片离子：x,yorz.但主要是形成a,b和y系列离子。PostSourceDecay特点：质谱图类似高能CID谱。,3).CID分类,2020/5/16,34,4)电子捕获碎裂(Electroncapturedissociation,ECD)反应在肽测序方面的应用,亮氨酸,异亮氨酸,2020/5/16,35,八、ESI质谱图的解释,1).蛋白质分子量的测定正离子质谱,ESImassspectrum,M+nHn+,Mr:平均分子量,DeconvolutedMassSpectrum,2020/5/16,36,).核苷酸分子量的测定负离子质谱,2020/5/16,37,).混合肽的质量测定,C18,C8andC4,去除小分子化合物,2020/5/16,38,2020/5/16,39,影响ESI因素：样品的pKa和溶液的pH。样品在电喷雾溶液中是否已预先形成离子取决于样品的pKa值。在低Ph值条件下有利于样品分子质子化，提高pH导致灵敏度和分子所带电荷的数目减少。在正离子检测中，溶液pH应较低，可用醋酸、三氟乙酸(TFA)调节。溶液pH通常至少低于样品的pKa2个单位。在负离子检测中，溶液pH应较高，可用氨水调节，使溶液pH比样品pKa高2个单位。溶剂的性质。溶剂应具有较低的汽化点，有较低的黏度和表面张力。常用的ESI溶剂有醇类、乙腈、丙酮、水等。常用混合溶剂及添加剂，如甲酸、乙酸、氨及挥发性缓冲液。去溶剂时干燥气体的温度和流速。应保持较高的温度及流速以利于去溶剂。但也应注意过高的温度可能导致样品分解。不能使用不挥发的无机盐缓冲液作为ESI的溶剂,2020/5/16,40,九、基质辅助激光解吸电离技术的应用MALDI-ToFMS,2020/5/16,41,Basiccomponentsofalinear(upperpanel)andreflecting(lowerpanelTOFmassspectrometer.,2020/5/16,42,1).常用的MALDImatricesat337nm(N2).,2020/5/16,43,2).MALDI-TOF-MS可容忍下列物质的最高浓度,2020/5/16,44,MALDI-TOFspectraofbovineinsulin,3).蛋白质分子量的测定,M+Na,KLi,2020/5/16,45,MALDIpeptideMap,4).肽分子量的测定,2020/5/16,46,5).肽序列的测定,a).CID测序，方法与ESI相同.,2020/5/16,47,PSDmassspectrumofsubstancePinCHCAemployingRE-TOF-MS.15kVacceleratingpotential,50laserpulsesaveragedforeachreflectorvoltagesegment.,b).PSD测序,2020/5/16,48,Laddersequencingoftheadrenocorticotropichormone(ACTH)fragment18-39utilizingtheCPYdilutiontechniqueandMALDIlinearDE-TOF-MS.25kVacceleratingpotential,150nspulsedelay,1.30kVpulse,50laserpulsesaveragedforeachspectrum.,carboxypeptidaseY(CPY)羧酸酶,ThesequenceofthepeptidefromtheC-terminuscanbereaddirectlyfromthemassspectrumbydeterminingthemassdifferencebetweenadjacentpeaks.,c).阶梯测序,2020/5/16,49,MALDI-TOFspectrumofoxytocinpeptide,a)M+Na(K,Li)离子,6).注意事项,2020/5/16,50,MALDImassspectraofsubstancePinCHCAcomparingmassresolutionobtainedinthelinear(upper)andreflecting(lower)modesutilizingcontinuousionextractionatthresholdlaserirradiance.25kVacceleratingpotential,50laserpulsesaveraged.,b)分辨率高低对准确测定分子量的影响,2020/5/16,51,