玉米种子纯度鉴定方法 玉米种子纯度鉴定

玉米种子纯度鉴定方法 玉米种子纯度鉴定 摘要总结了几种玉米种子纯度的鉴定方法，包括籽粒形态鉴定法、幼苗鉴定法、田间小区种植鉴定法、生化指纹图谱鉴定法、DNA指纹图谱鉴定法等内容，以期为玉米种子的标准化鉴定提供参考。 关键词玉米种子；纯度；鉴定方法 S513；S339.31 B 1007-5739（xx）03-0103-02 玉米种子纯度鉴定包括品种真实性和品种纯度鉴定，品种真实性是指一批种子所属品种、种或属与品种描述（标签和品种描述等）是否相符。品种纯度是指品种个体和个体之间在特征特性方面典型一致的程度，用本品种的种子数（或株、穗数）占供检本作物种子数（株、穗数）的百分率表示1。玉米种子纯度是玉米种子分级的主要依据，是决定玉米产量高低的重要因素之一，而且是种子包装必须标注的指标之一。企业生产和销售的每一批种子都必须经过严格的纯度检验，为了方便、快速、准确地鉴定种子纯度，对其方法的研究显得尤为重要。 1籽粒形态鉴定法 籽粒形态鉴定法主要是利用种子的花粉直感现象，来判断种子是否杂交，从而鉴定种子纯度的方法。种子个体性状的遗传信息是由DNA成对的显性基因和隐性基因决定的，当代种子表现其显性性状，F0代种子的胚乳是由母本子房接受父本花粉发育而来，并表现出花粉显性的直感现象，从而表现父本种子的显性特征。例如，以黄早四类型为母本，以籽粒深色型为父本的玉米种子可以利用籽粒形态鉴定法，由于母本籽粒浅黄透明、白顶等性状是由隐性基因所控制，而其父本深黄色、不透明、黄顶等性状是由显性基因所控制，其F0代种子由于花粉直感现象，籽粒变为黄色或深黄色、透明度差、无白顶现象。利用此种籽粒变化来鉴定品种真实性和品种纯度。籽粒形态鉴定法虽然省时、省工，靠种子检验工作者的经验，但具有很大的局限性，只有特定组合才可以利用此方法。特别是在种子调运过程需做出快速判断时才可以应用。 2幼苗鉴定法 幼苗鉴定法主要是利用幼苗芽鞘色和第1叶的叶尖颜色在杂交前后的变化来鉴定种子纯度的方法。主要用于母本芽鞘色是绿色或浅色的，而父本芽鞘色是深紫色的，或者是母本第1叶叶尖无色，而父本第1叶叶尖是深色的组合。由于深色对绿色和浅色是显性，在F1代表现显性性状。如果母本芽鞘为绿色和浅色的，和父本（芽鞘为深色的）杂交后，在F1代叶鞘颜色变深的为杂交，仍为绿色和浅色的为自交。例如，鲁单50就是此种组合，母本鲁原92芽鞘色为绿色或浅紫色，父本齐319芽鞘为深紫色，杂交后F1代幼苗芽鞘变深色的为杂交，仍为绿色和浅紫色的为自交。该方法鉴定省时、省工，但只有特定组合才能使用。 3田间小区种植鉴定法 田间小区种植鉴定法是玉米种子纯度鉴定中最准确、最可靠的方法。主要是根据玉米的表现型（植株学特性）来鉴定品种的真实性和品种纯度，这种植物学特性主要包括叶色、叶宽、雄穗分枝数、花药色、花丝色、轴色、粒色、穗型等2。田间小区种植鉴定法虽然费用高、速度慢，而且与大田生产同步，不能预先知道种子纯度，但其是目前最可靠的鉴定方法，鉴定结果被普遍认可，也是用于仲裁鉴定的方法。 4生化指纹图谱鉴定法 利用生化指纹图谱鉴定玉米种子纯度是近几年发展起来的纯度鉴定方法，主要是借助电泳技术区分玉米种子不同品种的某一组分之间的差异，建立标准的指纹图谱，把某一品种的指纹图谱与标准图谱进行比较，从而鉴定玉米种子的真实性和品种纯度。生化指纹图谱主要有同工酶电泳技术和种子储藏蛋白电泳技术，目前普遍应用的是种子贮藏蛋白电泳技术3。该鉴定方法费用低、操作简单、结果可靠、重演性好，但是也有一些品种不能用此种方法鉴定，也不能区分亲缘关系较近的品种。 4.1同工酶电泳技术 同工酶是具有相同催化功能而结构及理化性质不同的功能蛋白质，其结构的差异基因型的差异。从而根据这种差异来鉴定品种真实性和品种纯度。目前，脂酶和过氧化物同工酶电泳有一定的应用。 4.2种子贮藏蛋白电泳技术 玉米种子贮藏蛋白分子量分布范围较窄，但蛋白质组分之间的电荷差别较大。通过电泳技术的浓缩效应、分子筛效应、电荷效应的作用下，可以把蛋白质区分开，经过染色显示蛋白质谱带类型，蛋白质的不同是由内部的DNA决定的，利用蛋白质的谱带差异来鉴定品种的真实性和品种纯度。目前，已经利用的主要有醇溶蛋白等电聚焦电泳（IEF）和盐溶蛋白聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE），现在的种子企业和科研单位普遍应用PAGE。在相当长的一段时间内还会应用此种方法。 5DNA指纹图谱鉴定法 DNA指纹图谱的建立使玉米纯度检验从形态观察进入到基因水平。以品种的DNA片段作为检测对象，通过电泳技术来发现品种之间DNA的结构和组成的差异，建立品种DNA指纹图谱，用以鉴定品种真实性和品种纯度。目前以PCR扩增为基础的SSR、AFLP、RAPD技术和以杂交为基础的RFLP技术有了比较广泛的应用。DNA指纹图谱鉴定结果准确，应用范围广，但是鉴定费用高，所要求的技术含量高，不能满足种子企业快速鉴定玉米种子纯度时的需要。但用该方法鉴定玉米种子纯度不受季节、自然和环境因素的限制和影响，是今后的发展方向，要建立标准图谱，建立标准化的鉴定过程，降低鉴定费用还需要相当长的一个过程。 5.1RFLP技术 限制性片段长度多态性（Restriktion Fragment Length Polymorphism，RFLP）是指一个品种的DNA片段长度多态性，反映了DNA序列中核苷酸排列顺序的差异，RFLP标记的多态性基因组限制性酶切位点的突变及相邻位点间DNA结构重排（包括缺失、重复、异位和插入）。用限制性内切酶酶切不同品种的DNA，通过琼脂凝胶电泳分离大小不同的DNA片段，转移凝胶中的DNA到尼龙膜或硝酸纤维素膜上，用放射性同位素或生物素标记的探针进行Southern杂交，经放射显影后，可观察待鉴定品种的RFLP指纹，经与标准品种RFLP指纹图谱比较后，即可对此品种进行纯度分析。 5.2RAPD技术 随机扩增多态性DNA（Random Amplified Polymorphik DNA，RAPD）是以DNA为模板，以一个随机的寡核苷酸序列为引物，通过PCR扩增反应，产生不连续的DNA产物，扩增产物经琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳后，用EB或银染色，以检测DNA序列的多态性4。RAPD多态性与随机引物结合的靶位点的突变，或引物结合位点间DNA碱基序列的缺失和插入。RAPD多态性是由于引物结合位点的突变引起的，则属显性标记，若引物结合位点不变，而是由引物结合位点间短的片段缺失、插入而引起的，则属共显性标记。属于显性标记的无法区分杂合基因型与纯合基因型。 5.3SSR技术 在高等生物基因组中普遍存在着16个碱基组成的简单重复系列（Simpie Sepuence Reapeat，SSR），亦称微卫星DNA。微卫星位点两侧的序列是相当保守的单拷贝序列，因此可以根据两侧序列设计1对引物进行PCR扩增，然后经聚丙烯酰胺凝胶电泳或高浓度琼脂糖凝胶电泳分离扩增产物，经EB或银染色，从而精确地检测出特定位点微卫星DNA的长度多态性。这种长度差异反映了不同基因型个体在特定微卫星DNA位点的多态性。利用此来鉴定品种真实性和品种纯度。 5.4AFLP技术 扩增片段长度多态性（Amplification Fragment Length Polymorphism，AFLP）是指植物基因组DNA经限制性内切酶的酶切后，形成分子量大小不等的随机限制性片段，然后将特定的接头连接在这些DNA片段的两端，形成一个带接头的特定片段，再通过接头序列和PCR引物末端的识别进行PCR扩增，最终通过聚丙烯酰胺凝胶电泳将这些特异的限制性片段分离开来，从而显示出扩增片段长度的多态性。 6 _ 1 赵疆华.玉米种子室内纯度测定技术应用J.农业科技