confocal原理本科生实验02.ppt

,激光扫描共聚焦显微镜原理及应用2009年10月,Confocal原理及应用,Confocal原理,什么是Confocal？,LSCM（LaserScanningConfocalMicroscope）激光扫描共聚焦显微镜,1955年，MarvinMinsky为了观察活体脑组织中的神经网络，首次提出了共聚焦显微镜的基本原理,1）激光作光源；2）扫描成像；3）共聚焦光路设计；4）荧光显微镜,Confocal原理,荧光显微镜,落射荧光光路(EPIFluorescenceOptics),Confocal原理,激光光源,激光光源具有如下优点：,1）单色光；2）高强度；3）方向性好（点光源）；4）偏振光,多线氩离子激光器(457，477，488，514nm)氦氖激光器(543，594，633nm)固体激光器（408，488，561，640nm）,Confocal原理,激光光源,激光器,Confocal原理,扫描成像,LSCM采用逐点成像方式，通过软件重建出完整视野,采用X，Y扫描振镜精确控制激光点的位置，对整个视野进行扫描,Confocal原理,Confocal光路,针孔的采用，是Confocal光路的关键所在,ThreePoints,ApointlightsourceforilluminationApointlightfocuswithinthespecimenApinholeattheimagedetectingplane,针孔正好位于物镜焦平面上的点所成像的位置；针孔起到一个很好的“过滤”作用，挡掉来自非焦平面上信号的干扰,Confocal原理,Confocal光路,PMT,Confocal原理,PMT,PMT,Confocal光路,PMT,Confocal原理,Confocal光路,PMT原理,Confocal原理,PhotomutiplierTube,Confocal原理,PMT原理,通过衍射形成图像。在物镜共轭平面探测图像。分辨率和对比度由相同的因素决定。显微镜的光学装置的选择标准相同。像差对图像的影响相同,宽场图像在整个视场同时形成，共聚焦显微镜图像是一个像素一个像素进行扫描获得的。宽场图像在图像平面成一实像。共聚焦图像只是暂时存在于图像共轭平面。共聚焦图像在空间上通过共聚焦针孔来过滤。,相似点,不同点,Confocal原理,confocal和普通显微镜的异同点,Confocal原理,Confocal和普通宽场荧光图像比较,Confocal原理,Confocal和普通宽场荧光图像比较,Confocal原理,Confocal的优点,Confocal原理,NikonC1Si所采用的技术,Confocal软件,界面整体,Confocal软件,拍摄界面,选择激光选择探测通道设定扫描分辨率预览（图像连续更新）调节焦距，设定扫描区域调节针孔调节象素扫描时间调节每个通道的增益调节激光强度,Confocal软件,激光波长选择,408nmDapi,CascadeBlue,BFP,CFP440nmCFP,FuraRed,LuciferYellow488nmGFP,Alexa488,FITC,DiO514nmYFP,TOTO-1,CalciumGreen543nmDSRed,Cy3,TRITC,DiI594nmAlexa594,TexasRed640nmCy5,TOPRO-3,DRAQ-5,Confocal软件,得到最佳图象效果,通过调节Gamma,饱和度,和darklevel，使图像显示和伪彩色显示相匹配,得到最佳图像显示质量.,Confocal软件,Zstack序列图象,软件可以根据物镜选择最佳步径。在您想要拍摄的stack范围内选择一个切面，得到优质图象。选择感兴趣范围选ref，点红色按钮设置参考位置调节焦距，设置顶部和底部位置，注意过饱和指示，优化增益值选择Z-stack必要时选择Average提高信噪比调节分辨率点single获取Z-stack图象,Confocal应用,应用分类,Confocal的应用大致可以分为3类：,1）常规应用：这类应用通过普通荧光显微镜也可以实现，但Confocal要做的更好或者好得多；2）专有应用：这类实验利用了Confocal专有的特性；3）光谱应用：利用Confocal的光谱特性设计实验,Confocal应用,常规应用,利用Confocal进行空间定位：,1）免疫荧光标记（单标、双标或三标）的定位如：细胞膜受体或抗原的分布,微丝、微管的分布、两种或三种蛋白的共存与共定位、蛋白与细胞器的共定位；2）细胞凋亡机制；3）荧光原位杂交,杂色体基因定位；4）细胞骨架装配：分析正常及癌变细胞中细胞骨架与核改变之间的关系；5）细胞黏附行为,Confocal应用,常规应用,多个荧光通道的叠加：,Confocal应用,常规应用,荧光通道和DIC通道的叠加：,BuddingyeastcellsExpressingafusionofGFP(S65T,V163A)totheendoplasmicreticulummembraneproteinSEC63p,Confocal应用,常规应用,3D重建和分析：,Confocal应用,常规应用,3D重建和分析：,Aretinalganglioncell,Confocal应用,常规应用,活细胞动态记录：1）分子的运动；2）细胞的增殖分裂；3）细胞突起的运动；4）细胞、组织的生长发育,神经元生长锥倾向于向AchR的方位生长JNeurosci.2006Jan18;26(3):934-47,Confocal应用,常规应用,多维记录：1）XYZT；2）XYZ入；3）XYZT入；4）XYZT多点拍摄；5）XYT入,Confocal应用,常规应用,定量测量：1）活细胞或组织内游离Ca2+浓度的测量(Mg2+、Zn+、Na+、K+)；2）活细胞内H+浓度（pH值）的测量；3）自由基的检测；4）药物进入细胞的动态过程、定位分布及定量；5）荧光共振能量转移（FRET）,PseudocoloredimagesofchangesinintracellularfreeCa2+inAtT-20/D16v-F2cells,monitoredat9-secondintervalswithfluo-4,AM,Confocal应用,常规应用,定量测量：,FastconfocalrecordingofspontaneousCa2+sparksinaratventricularmyocyte.Singlemyocyteswereisolatedfromratheartsandloadedwithfluo-4,AM,CLSM使用技术要点,样品的准备样品的荧光标记LSCM的基本操作,样品准备,样品的最大厚度大约12mm(10/0.4物镜),它取决于物镜的数值孔径(NA)、物镜的工作距离、激光的穿透力以及样品的透明度。一般要求是单层贴壁细胞,可以是经荧光探针标记(单标、双标、三标)固定的或活的组织、固定的或活的贴壁培养细胞、用盖玻片封片的经甩片或滴片后的悬浮细胞。对于非贴壁细胞的粘贴,一般常用的粘贴剂有多聚赖氨酸伴刀豆球蛋celltakvectabond琼脂凝胶等。选择粘贴剂的标准是:不影响实验目的,对标本无损害.,样品荧光标记,荧光探针的选择:一般情况下应根据研究目的、研究方法、所用机器类型选择合适的荧光探针种类和商品形式。如需要进行两种以上的荧光标记时,应当注意这两种荧光探针的性质:如激发波长是否可以分开,颜色是否相同,对环境温度的敏感性等。荧光探针的负载:染色过程的一般原则是在保证一定信噪比的前提下,尽量降低所用荧光染料的浓度,消除其对待测离子的缓冲作用。根据荧光染料的不同,一般可采用孵育显微注射转基因或经膜片钳微电极尖端导入细胞等方法进行负载。胞内染料浓度及分布由细胞的生理参数及具体的实验条件决定.对于不同的样品,荧光探针的负载条件应在不断探索中完善.,CLSM基本操作,显微镜的基本操