miRNA研究策略及技术.ppt

,miRNA研究策略及技术,RNA干扰,RNA干扰（RNAinterference，RNAi）是指一种由双链RNA诱发的基因沉默现象，其机制是通过阻碍特定基因的翻译或转录来抑制基因表达。microRNAs(miRNAs)：mRNA翻译被抑制shortinterferingRNAs(siRNAs)：引起mRNA切割,干扰机制,miRNA简介,microRNAs（miRNAs）是一种小的内源性非编码RNA分子，大约由2125个核苷酸组成。通常靶向一个或者多个mRNA，通过翻译水平的抑制调节基因的表达。动物的靶序列在3非编码区（3UTR）植物的靶序列在编码区或5UTR,miRNA生成,miRNA途径开始于一个miRNA基因的pri-miRNA（primarymiRNA）转录本；这个70100nt的发卡RNAs（pri-miRNA）在核内被核糖核酸酶Drosha加工处理而最终成为pre-miRNA（precursormiRNA）pre-miRNA被核输出蛋白exportin5转运入胞质，接着被第二个核糖核酸酶Dicer消化为2125nt的miRNA；这个阶段的miRNA可以结合RISC（RNA-InducedSilencingComplex）并与靶标mRNA互补图例,miRNA研究流程,miRNA的筛选,深度测序抽提分离小分子(例如18-30nt)RNA，通过RT-PCR扩增之后，利用solexa深度测序，并进行生物信息学分析，获得miRNA表达谱。深度测序结合生物信息学分析手段，可以对海量数据进行分析，分别统计出已知的miRNA(miRNA-known)、新的miRNA(miRNA-new)以及可能的新miRNA(miRNA-cadidatenew)，并对新发现的miRNA进行靶基因分析，功能预测等。,miRNA芯片利用miRNA芯片，可以高通量分析miRNA表达的时空特异性、不同样本(例如癌组织和癌旁组织)中miRNA的差异表达，寻找在生物学功能上起作用的miRNA,实例：,miRNA表达检测,目前检测miRNA的技术主要有以下几种：Northern杂交原位杂交微点阵（microarray）实时定量PCR,Northern杂交,实例：,原位杂交,实例：,实时定量RTPCR,Loop反转录法每次RT只能检测一个miRNA特异性高多个样本中检测同一miRNApolyA加尾法一次RT可检测所有miRNA通用性高适合miRNA高通量检测,引物设计,1.通常情况下，ForwardPrimer序列与待测miRNA序列基本一致，只要将原有的U替换成T即可。例如：,2.在特殊情况下，例如当miRNA分子中GC含量偏高时，可在miRNA序列3端减少34个碱基，从而降低引物的Tm值；相反，如果miRNA分子中GC含量偏低时，可在miRNA序列5端添加几个GC碱基，从而提高引物的Tm值。例如：,*1OLIGO:PrimerAnalysisSoftware。*2Primer3:（/ftp/distribution/software/）*3/BLAST/,实例：,miRNA功能研究,用特定试剂改变内源miRNAs的水平，观察靶mRNA及编码蛋白的表达，进行信号通路研究功能获得研究：把miRNA导入细胞miRNAmimics：化学方法合成的miRNA模拟物miRNA表达克隆功能缺失研究：抑制miRNA表达miRNAinhibitormiRNA抑制剂表达克隆,过表达miRNA,将miRNAmimics转染到细胞中，能实现miRNA瞬时过表达构建miRNA表达载体可进行长期研究过表达载体中有插入成熟miRNA、pre-miRNA及pri-miRNA序列三种形式载体选择有三种：慢病毒，腺病毒，质粒,抑制miRNA,miRNA抑制剂克隆导入细胞后表达的miRNA抑制剂(miArrest)特异地结合它们的靶miRNA，形成稳定的复合物，阻止了miRNA对靶标mRNA的降解或者翻译抑制，上调miRNA靶标基因的表达,化学合成的miRNA抑制剂是序列特定的、单链寡核苷酸分子，适合瞬时转染,miRNA靶基因的寻找,miRNA的靶基因的寻找主要通过利用生物信息学方法和生物学实验方法。生物信息学方法主要是利用某种算法对靶基因样本进行评分及筛选。为了得到更为可靠的靶基因预测，通常综合多个预测方法，取其共同预测的基因作为研究重点。,常用miRNA靶标数据库,miRbase：microRNA基因注释数据库。目前只提供了microRNA的靶标的预测软件的链接（如：PicTar）。网址：/index.shtmlTarbase：一个收集已被实验验证的microRNA靶标数据库。网址：http:/microrna.gr/tarbase/targetScan:基于靶mRNA序列的进化保守等特征搜寻动物的microRNA靶基因。是预测microRNA靶标假阳性率较低的软件。网址：/PicTar：基于microRNA或microRNA靶标联合作用等特征开发的搜寻动物的microRNA靶基因的软件，假阳性率也较低。网址：http:/pictar.mdc-berlin.de/,实例：,miRNA靶基因的鉴定,利用荧光定量PCR及Westernblot方法分别检测转染或敲除miRNA后细胞中mRNA水平及蛋白水平的变化,从而确定miRNA与靶基因的对应关系。,miRNA靶位点的鉴定,荧光素酶报告基因法基本原理是首先构建荧光素酶表达载体,将希望鉴定的miRNA靶基因的3UTR构建到荧光素酶基因的3UTR中,然后将荧光素酶基因表达载体,转染细胞并改变细胞中相应miRNA的表达水平，最后检测荧光素酶的表达情况以分析转染3UTR中是否含有miRNA的靶位点。,荧光素酶报告系统,双荧光素酶报告基因测试结合萤火虫和海肾荧光素酶的共报告基因测试技术,多克隆位点,技术流程,获得miRNA对应DNA模板扩增含有靶位点的3UTR序列靶序列克隆，构建到荧光素酶表达载体PCR产物双酶切，连入同样双