《质粒的提取和电泳》PPT课件.ppt

观察昨天实验课的结果,1、观察自己组的实验结果：转化平板*培养板在37C培养12-16h卫星菌：培养时间过长2、实验中的难点*制备效率高的感受态细胞,重组质粒的鉴定,如何鉴定平板上的菌落为含有重组质粒的菌落？,小量制备质粒和电泳分析,质粒,质粒载体,是存在于细菌染色体外的小型闭合环状双链DNA分子，在宿主细胞内可独立自主复制并赋予宿主细胞一定的遗传性状,筛选标记MCS（多克隆位点）复制原点,质粒,1)培养细菌使质粒扩增；2)收集裂解细菌；3)分离纯化质粒DNA。,质粒提取原理：,质粒提取有多种方法，但都包含有3个基本步骤：,去除蛋白质,去除基因组DNA,去除RNA,*酚-氯仿抽提法,*RNase消化,？,质粒DNA与基因组DNA的区别,大肠杆菌遗传物质,1、部位不同：2、大小不同：,质粒分子量较小，大小只有普通细菌染色体DNA的百分之一。基因组DNA分子量较大，细菌基因组约含3000个基因，5106bp。基因组DNA容易断裂线性化,提取的质粒的方法：,特点：小量质粒制备、最简便、快捷应用：质粒酶切鉴定、克隆（粗提）测序、转染（细提）,1.小量碱裂解法,2.质粒提取试剂盒,纯化原理：离子交换柱层析等,小量制备质粒kit,大量制备质粒kit,去除内毒素制备质粒kit,质粒提取试剂盒可用于大部分分生实验，本次试验不进行实验操作，只讲解结果分析。,碱裂解法提取质粒的原理,原理：1、强碱和SDS裂解细菌，细菌中的质粒或基因组DNA在碱性条件下发生变性。2、怎样去除基因组DNA？当加入酸性物质进行中和时，质粒DNA很快复性，染色体DNA则和变性蛋白质等缠绕在一起难以复性而形成沉淀，经离心随细胞碎片一起去除；3、怎样去除蛋白质？（已经学过）留有质粒DNA的上清，经酚和氯仿去除蛋白质后,用乙醇沉淀质粒DNA，即得到质粒DNA.,1)细胞悬浮液（溶液I）-悬浮菌体50mmol/L葡萄糖25mmol/LTris.HclPH8.010mmol/LEDTA.Na2PH8.02)细菌裂解液（溶液II）-裂解菌体0.2mol/LNaOH1%SDS,碱裂解法提取质粒试剂：,3）中和液（溶液III）-中和NaOH60ml5mol/L醋酸钾11.5ml冰醋酸28.5ml水4）20mg/mlRNase-降解细菌RNA工作浓度3050g/ml其他试剂作用和成分同实验一。,质粒DNA的制备,（1）（细菌的收获：）取1.5ml工程菌液6,000转/分，离心2min，弃上清。（2）（细菌的裂解：）加入200l预冷的细胞悬浮液（溶液I）悬浮细菌加入200l细菌裂解液（溶液II），颠倒混合离心管内容物，待溶液变粘稠为止。注：粘稠：开盖后出现拉丝现象，证明DNA已经游出。（3）（中和：）加入150l中和液，上下颠倒混合后置冰上5min，12,000转/分，4离心5min。,碱裂解法提取质粒操作步骤,（去除蛋白质）（4）将上清移至另一离心管中(注意不要混入白色沉淀物)，加入等体积的TE饱和的酚/氯仿/异戊醇(25：24:1)混和液，振荡混匀1min，12,000转/分离心5min。（5）将上层水相移至另一离心管中，加入等体积的氯仿/异戊醇(24:1)溶液，振荡混匀1min，12,000转/分离心5min。（沉淀DNA）（6）将上层水相移至另一离心管中，加入2.5倍体积的无水乙醇，置-20沉淀1015min。,上午实验结束,（7）12,000转/分离心5min。弃上清，室温干燥质粒DNA5-10min。（去除RNA）（8）用20l含RNase的水溶解质粒DNA，轻轻吹打混合。37保温10min,20l质粒DNA溶液,取出10l放于另一个离心管中备用,剩余10l用于下一步酶切,重组质粒的鉴定,平板筛选：大多数情况下，平板筛选只能区分含有或未含有质粒的细胞，却无法区分含有空质粒或重组质粒的细胞,提取的质粒,质粒电泳筛选重组质粒,重组质粒的进一步酶切鉴定,质粒的电泳,质粒DNA的3种形式泳动速度:超螺旋线性开环,质粒DNA的存在形式有3种:1、共价闭环DNA:常以超螺旋形式存在2、开环DNA:质粒DNA两条链中有一条发生一处或多处断裂，因此可以自由旋转从而消除张力,形成松弛的环状分子3、线性DNA:因质粒DNA的两条链在同一处断裂而造成.,开环,超螺旋,线性,一、重组质粒的酶切在一微量离心管中加入：1.重组质粒DNA10ul2.10XBufferM2ul3.EcoRI0.5ul4.Hind0.5ul5.去离子水6ul总体积20ul置37，45min。,琼脂糖凝胶电泳鉴定质粒的酶切结果,取10ul酶切后的质粒加23ul电泳上样液，混匀。加入点样孔电泳：100伏，40分钟。注：可将5ul未切的质粒作为对照。,质粒电泳,空质粒,重组质粒,重组质粒分子量变大而在电泳中滞后,质粒酶切电泳,a:酶切前,b:酶切后,插入片段,注：观察质粒的电泳带型分析质粒切不开的原因。,4.CR产物与T载体连接,3.RT-PCR,5.转化,2.提取RNA、电泳,实验课总结-基因克隆总结,1.基因组DNA提取、酶切、电泳,（1）基因组DNA提取、酶切、电泳,建立基因组文库的第一步人类基因组测序的第一步Southernblot的第一步,Smear,123,（2）RNA的提取、电泳,28S,18S,RT-PCR的第一步，也是目的基因获得的第一步；Northernblot的第一步；,注意：RNA提取过程中主要避免RNA酶的污染。,（3）PCR及电泳分析,1)获得目的基因的最常用方法；2)可以进行探针标记；3)可以进行基因的定点突变4)PCR酶切片段长度分析（PCR-RFLP）；5)可以定量分析基因含量（realtimePCR）.,注意：引物设计是非常重要的。,（