《色谱条件的选择》PPT课件.ppt

色谱条件的选择讲稿山东大学王吉顺2005.8,色谱条件包括以下内容：1.仪器：生产商，型号2.色谱柱：柱商品名称，填料商品名称，填料类型，色谱柱长度（cm）和内径（mm），填料粒经（um）3.流动相：流动相组成和比例，流速（ml/min）4.检测器：型号及参数（如波长nm）5.进样量：体积（ul）6.柱温：（）其中我们更为关心的是：色谱柱和流动相（本章节主要讨论的问题）,色谱柱的选择,大多数化合物是可以使用C18柱分离C18优点：柱便宜，流动相便宜，使用时间长，易于通过改变流动相得到最佳分离，药品本身具有纯度高的特点，容易分离，辅料和分解产物是分离的难点。比中药成分的分离，体液中药物成分的分离，微量成分的分离，杂质成分的分离，食品中药物残留的分离简单的多。,选择色谱条件的方法,1查文献，学习别人的方法2文献中没有的新药和新化合物可以使用结构类似化合物的色谱条件3自己积累药物分析的色谱条件，从中寻找规律，尤其是要总结解决问题的方法。把自己积累的方法用于以后的色谱分析中。不建议在自己对被分离物质的性质不了解的情况下，自己摸索色谱条件,色谱柱的分类,1根据担体材料分类（1）硅胶型：SiO2；C18；C1三甲基；C2；C4；C8；CN；NH2；苯基（2）聚合物型：聚苯乙烯类（离子交换；凝胶色谱柱）；聚丙烯酸酯（离子交换）；聚乙烯醇：C18；离子交换（3）钛柱：比硅胶型的稳定性提高（4）其它类型,色谱柱的分类,2.根据分离方式分类(1)正相：SiO2；CN；NH2；苯基(2)反相：C18；C1三甲基；C2；C4；C8；CN；NH2；苯基(3)离子交换：弱碱阴离子交换；弱酸阳离子交换强碱阴离子交换；强酸阳离子交换(4)凝胶过滤：水溶性凝胶过滤；油溶性凝胶过滤(5)其它类型：手性柱等,色谱柱的分类,3.根据色谱柱尺寸分类（1）10cm50cm内径为制备柱（2）4cm8cm内径为标准柱（3）3cm一下内径为小孔柱或微孔柱和毛细管柱（4）柱长一般为15cm、25cm、30cm；50cm一般用于制备柱或特殊柱型，5cm一下为快速柱(包括预柱和保护柱),色谱柱选择方法,1.氨基酸(1)结构特殊，一般使用离子交换柱分离，阳离子交换柱是使用最广泛,是最成熟的方法。分离氨基酸的阳离子柱分为锂型柱和钠型柱，锂型柱可以分离谷氨酰胺和谷氨酸。(2)反相柱也可以分离氨基酸，但不能分离所有氨基酸。柱前衍生化法分离水解氨基酸也非常有效，且方法简便，所用的仪器简单。,氨基酸分析,分析条件：色谱柱：Shim-pakISC-07/S1504Li（15cm4.0mm）（Li型磺酸基，氨基酸分析专用柱）流动相：柠檬酸缓冲溶液，梯度洗脱流速：0.3ml/min柱温：55检测器：荧光（Ex.238nm,Em450nm）方法：OPA柱后衍生化法,色谱柱选择方法,肽和蛋白质凝胶过滤：根据分子量的大小差别进行分离离子交换：根据分子所带的电荷的差别进行分离反相和疏水色谱：根据分子的疏水性质的差别进行分离亲和色谱：根据复合的相互作用的差别进行分离,蛋白质,分析条件：色谱柱：Shim-pakDiol300（50cm7.9mm）（二醇基水溶性凝胶柱，蛋白质分析专用柱）流动相：10mM磷酸缓冲液（pH7）和0.1MNaCl流速：1.0ml/min柱温：室温检测器：紫外（280nm）色谱峰：1.谷氨酸脱氢酶2.乳酸脱氢酶3.烯醇酶4.腺苷酸激酶5.细胞色素C,蛋白质,分析条件：色谱柱：Shim-pakDiol300（50cm7.9mm）（消除残留硅醇基C2柱，300A多孔硅胶）流动相：硫酸铵/磷酸缓冲液（pH7）梯度洗脱流速：0.5ml/min柱温：室温检测器：紫外（220nm）色谱峰：1.细胞色素C2.肌红蛋白3.核糖核酸酶A4.铁传递蛋白5.糜蛋白酶原A,色谱柱选择方法,核酸核酸在生命科学领域中占有重要位置，在今后的新药研发领域中同样占有重要位置。核酸可以分为一下三类：腺嘌呤（核酸碱基）腺苷（核苷；核酸碱基糖）腺苷酸（核苷酸；核苷磷酸）腺嘌呤（核酸碱基）和腺苷（核苷；核酸碱基糖）用阳离子交换柱或反相柱进行分离；腺苷酸（核苷酸；核苷磷酸）用阴离子交换柱分离，选择合适的流动相也可以用反相柱进行洗脱；,核酸,分析条件：色谱柱：Shim-pakWAX1（5cm4.0mm）（叔氨基阴离子交换柱，用于分析核苷酸）流动相：20mM磷酸缓冲液（pH7）480mM磷酸缓冲液（pH6.8）梯度洗脱流速：1.0ml/min柱温：45检测器：紫外（260nm）色谱峰：1.尿苷酸2.胞苷酸3.腺苷酸4.鸟苷酸5.尿苷二磷酸6.胞苷二磷酸7.腺苷二磷酸8.尿苷三磷酸9.鸟苷二磷酸10.胞苷三磷酸11.腺苷三磷酸12.鸟苷三磷酸,核酸,分析条件：色谱柱：Shim-pakSBCC8（15cm2.5mm）（小孔径硅胶键合C8）流动相：20mM磷酸二氢钾缓冲液/甲醇（93/7）流速：0.5ml/min柱温：室温检测器：紫外（260nm）色谱峰：1.胞苷2.尿苷3.鸟苷4.胸苷5.腺苷,核酸,分析条件：色谱柱：ODS柱（15cm6.0mm）（经甲烷基化处理的ODS柱）流动相：100mM磷酸缓冲液和200mM高氯酸钠溶液梯度洗脱流速：1.5ml/min柱温：50检测器：紫外（260nm）色谱峰：1.未知峰2.胞嘧啶3.尿嘧啶4.鸟嘌呤5.腺嘌呤6.胞苷7.尿苷8.胸腺激素9.腺苷10.鸟苷11.胸苷,色谱柱选择方法,糖的分离糖的种类很多，可分为单糖（木糖，阿拉伯糖；葡萄糖，果糖，半乳糖）、二糖（蔗糖，麦芽糖）、低聚糖和多糖。单糖和二糖可以使用氨基柱分离（分离异构体效果不很好），还可以使用阴离子交换柱分离，缺点是分离时间较长。低聚糖也可以使用氨基柱分离（分离异构体效果不很好），还可以使用水溶性凝胶过滤色谱柱进行分离（色谱柱价格较贵，色谱柱不易保存）。多糖使用水溶性凝胶过滤色谱柱进行分离。另外还用部分公司生产糖分析专用色谱柱。,糖的分离,分析条件：色谱柱：NH2柱（15cm6.0mm）（硅胶键合NH2柱）流动相：乙腈/水（7/3）流速：1.0ml/min柱温：室温检测器：示差折光色谱峰：1.丙三醇2.木糖3.果糖4.葡萄糖5.蔗糖6.麦芽糖7.乳糖,糖的分离,分析条件：色谱柱：磺化聚苯乙烯Ca型柱（30cm7.9mm）（分离机理为凝胶渗透配位交换）流动相：乙腈/水（7/3）流速：1.0ml/min柱温：室温检测器：示差折光色谱峰：1.丙三醇2.木糖3.果糖4.葡萄糖5.蔗糖6.麦芽糖7.乳糖,色谱柱选择方法,维生素的分离维生素分为水溶性维生素和脂溶性维生素水溶性维生素：维生素B，维生素C，维生素H，维生素P，泛酸等脂溶性维生素：维生素A，维生素D，维生素E，维生素K分离方式：和脂溶性维生素均可使用反相洗脱法分离。一些脂溶性维生素可以使用分配色谱法分离,维生素C的分离,分析条件：色谱柱：NH2柱（15cm6.0mm）（硅胶键合NH2柱，分配色谱）流动相：乙腈/10mM磷酸缓冲液（pH2.6）（3/1）流速：1.5ml/min柱温：40检测器：紫外（245nm）色谱峰：1.异抗坏血酸2.抗坏血酸,维生素E的分离,分析条件：色谱柱：SiO2柱（5cm4.6mm）（硅胶键合NH2柱，分配色谱）流动相：正己烷/二恶烷/乙醇（98/2/0.2）流速：2.5ml/min柱温：室温检测器：紫外（295nm）色谱峰：,维生素E的分离,分析条件：色谱柱：NH2柱（15cm6.0mm）（硅胶键合NH2柱，分配色谱）流动相：正己烷/异丙醇（25/1）流速：1.5ml/min柱温：40检测器：紫外（297nm）色谱峰：,维生素B族的分离,分析条件：色谱柱：ODS柱（15cm6.0mm）（硅胶键合NH2柱，分配色谱）流动相：【100mM硫酸钠（pH2.1）和1.2mM辛烷磺酸钠】/乙腈（9/1）流速：1.2ml/min柱温：40检测器：紫外（210nm）色谱峰：1.烟酸2.烟酰胺3.泛酸4.磷酸核黄素5.吡哆素6.咖啡因7.硫胺素8.核黄素,色谱柱选择方法,阴阳离子分离阴离子可以使用离子交换柱分离，也可以使用C18分离（离子对色谱法）。,离子交换法分离二价阳离子,分析条件：色谱柱：磺化聚苯乙烯磺酸基离子交换柱（15cm5.0mm）（离子交换色谱）流动相：0.3M乳酸水溶液流速：1.0ml/min柱温：40检测器：电导色谱峰：,离子对色谱法分离阴离子,分析条件：色谱柱：ODS柱（15cm6.0mm）（硅胶键合NH2柱，分配色谱）流动相：0.8mM苯三酸和10mM四丁基氢氧化铵（pH4.6）流速：1.5ml/min柱温：40检测器：紫外（282nm）色谱峰：,色谱柱选择方法,非极性化合物和弱极性化合物一般使用ODS均可分离。被测样品在流动相中微溶，如果溶解度大则出峰较快，不溶则不出峰。芳烃一般作为ODS柱的柱效测试样品，以甲醇水作流动相便可得到对称峰型，否则色谱柱有问题。如果非极性化合物和弱极性化合物在ODS上拖尾，四氢呋喃是很好的减尾剂。带有氨基的有机化合物是检验ODS柱是否封端的指示剂（如尿嘧啶）。,色谱柱柱效测定方法,分析条件：色谱柱：ODS柱（15cm6.0mm）流动相