DNA甲基化实验PPT课件

,DNA甲基化的检测,表观遗传学系列实验之,1,.,Content,DNA甲基化简介,DNA甲基化的生物学意义,DNA甲基化的检测方法,2,.,1.DNA甲基化简介,DNA甲基化：在DNA甲基转移酶(DNAmethyltransferase,DNMTs)的作用下，以SAM为供体，将一个甲基添加到胞嘧啶的5-碳分子上，形成5-甲基化胞嘧啶，主要发生在CpG位点。,哺乳动物基因组中约有5%-10%是CpG位点，其中约有70%为mCpG。CpG位点不是均匀分布，而是呈现局部聚集倾向，形成一些GC含量较高、CpG双核苷酸相对聚集的区域，即CpG岛，CpG岛通常呈现低甲基化状态。,3,.,可以简单地把DNA甲基化理解为“一把锁”，凡是被DNA甲基化标记的部分，大都是需要被“尘封”“监禁”的基因，比如基因组的“捣蛋鬼”转座子，就是被甲基化这把“锁”管制着，失去管制或管制不严，这些“捣蛋鬼”会在基因组里跳来跳去，把基因组搞得一团糟，会引起很多问题，如肿瘤、精神疾病等。,2.DNA甲基化的生物学意义,4,.,DNA甲基化与遗传物质的稳定性DNA甲基化与基因表达调控DNA甲基化与表观遗传学DNA甲基化与胚胎发育DNA甲基化与肿瘤,2.DNA甲基化的生物学意义,5,.,2.DNA甲基化的生物学意义,DNA甲基化与遗传物质的稳定性,研究证明细菌DNA复制起始与DNA甲基化以及DNA与细菌质膜的相互作用有关。DNA便甲基化作为一种标签决定了复制起始点与细胞膜的结合，控制了复制起始，使得DNA复制与细胞分裂保持一致。DNA错配修复（mismatchrepair）作为细胞增殖过程中纠正DNA复制错误的重要手段，对保证DNA复制的忠实性与基因组的稳定性起重要作用。复制后双链DNA在短期内（数分钟）保持半甲基化状态，错配修复系统从而能够区分“旧链”与“新链”，为校正新链中掺入的错误碱基提供了理想的分子标记。c)转座子失活，转座子存在有活性与失活的循环变化，这与DNA的甲基化相关。,6,.,基因启动区域内CpG位点的甲基化通过三种方式影响基因转录活性：DNA序列甲基化直接阻碍转录因子的结合；甲基CpG结合蛋白结合到甲基化CpG位点与其他转录抑制因子相互作用；染色质结构的凝集阻碍转录因子与其调控序列的结合；,2.DNA甲基化的生物学意义,DNA甲基化与基因表达调控,7,.,2.DNA甲基化的生物学意义,DNA甲基化与表观遗传学,基因组印迹是指在配子或合子发生期间，来自亲本的等位基因或染色体在发育过程中产生专一性的加工修饰，导致后代体细胞中两个亲本来源的等位基因有不同的表达活性的现象。其分子机理与甲基化密切相关，DNA甲基化模式的维持对基因印迹在亲子代之间的遗传是必须的。X染色体失活，生长发育过程中，雌性哺乳类动物细胞中的两条X染色体其中一条失去活性的现象。X染色体上存在一个与X染色体失活有密切联系的核心部位。核心区命名位X染色体失活中心。失活的染色体上DNA序列都呈高度甲基化，导致绝大多数基因转录处于关闭状态。,8,.,2.DNA甲基化的生物学意义,DNA甲基化与胚胎发育,在胚胎发育的不同时期，基因组范围内的DNA甲基化水平会发生剧烈的改变，改变最剧烈的阶段为配子形成期与早期胚胎发育阶段。DNA甲基化对胚胎正常发育和等位基因的选择表达至关重要，错误甲基化模式的建立将引起人类的疾病，如脆性X染色体综合症。,9,.,肿瘤细胞的特征：癌基因低甲基化被激活；抑癌基因高甲基化被沉默肿瘤中普遍存在DNA甲基化状态的改变，其特点是总体的甲基化水平降低与局部的甲基化水平升高。低甲基化可诱导原癌基因和转座子成分活化，基因印迹缺失以及染色体不稳定性增加，最终诱发肿瘤在整体低甲基化的水平下，某些抑癌基因发生高甲基化，导致基因沉默，对肿瘤抑制能力低下甲基化水平与肿瘤生物学特性密切相关，DNA甲基化水平越低，染色体越容易发生功能异常，肿瘤的浸润能力就越高，临床分期也愈晚,2.DNA甲基化的生物学意义,DNA甲基化与肿瘤,10,.,A基因组甲基化水平(MethylationContent)的分析:高效液相色谱(High-performanceLiquidChromatography,HPLC)高效毛细管电泳法(High-performanceCapillaryElectrophoresis,HPCE)适用于基因组整体的甲基化水平研究，无法定位甲基化位点。,B.甲基化敏感性限制性内切酶-PCR/Southern法(methylation-sensitiverestrictionEndonuclease-PCR/Southern,MSRE-PCR/Southern)，常使用的甲基化敏感的限制性内切酶有Hpa-Msp(CCGG)和Sma-Xmal(CCCGGG)等。,C.甲基化DNA免疫沉淀法(MethylatedDNAimmunoprecipitation,MeDIP)，特异性识别甲基化修饰DNA的抗体或蛋白。,D.重亚硫酸盐转化法(Bisulfiteconversion)-pyrosequencing，RRBS,BS-seq,3.DNA甲基化的检测,11,.,-重亚硫酸盐转化法(Bisulfiteconversion),实验原理,3.DNA甲基化的检测,重亚硫酸盐将DNA中未发生甲基化的胞嘧啶脱氨基转变成尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶保持不变，进行PCR扩增所需片段，则尿嘧啶全部转化成胸腺嘧啶。,12,.,3.DNA甲基化的检测,-重亚硫酸盐转化法(Bisulfiteconversion),实验步骤,细胞培养,基因组提取,重亚硫酸盐转化,PCR扩增,琼脂糖凝胶电泳,焦磷酸测序,13,.,细胞培养,3.DNA甲基化的检测,-重亚硫酸盐转化法(Bisulfiteconversion),Hela细胞系DMEM高糖培养基,14,.,3.DNA甲基化的检测,-重亚硫酸盐转化法(Bisulfiteconversion),2.基因组提取,血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒,15,.,在200l离心管中配制重亚硫酸盐反应体系，具体配制体系如下：DNA样品Xl(最佳DNA处理量为500-1000ng）ddH2O30-Xl(DNA与ddH2O的最大体积为30l)BisulteMix90lTotal120l反应体系配制好以后，在PCR仪等可设置温度变化程序的仪器上进行重亚硫酸盐转化，具体程序如下所示：95C10min64C30-60min4，；注：样品与CT转化试剂务必混合均匀。,3.DNA甲基化的检测,-重亚硫酸盐转化法(Bisulfiteconversion),3.重亚硫酸盐转化,16,.,1柱平衡步骤：向吸附柱CB1中(吸附柱放入收集管中)加入500l的平衡液BL，12,000rpm(13,400g)离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中(请使用当天处理过的柱子)。2重亚硫酸盐处理程序结束后，经过简短离心将管中反应体系转移至干净的1.5ml离心管中。3转移好以后，向其中加入5倍体积(600l)的结合液PB，充分混匀。4将上一步所得溶液加入吸附柱CB1中(吸附柱放入收集管中)，室温放置2min，12,000rpm(13,400g)离心30-60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB1放入收集管中。注意：吸附柱容积为800l，若样品体积大于800l可分批加入。5向吸附柱CB1中加入600l漂洗液PW(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12,000rpm(13,400g)离心30-60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB1放入收集管中。,3.DNA甲基化的检测,-重亚硫酸盐转化法(Bisulfiteconversion),3.重亚硫酸盐转化DNA回收,17,.,6.向吸附柱CB1中加入600l溶液DB，室温(15-25)放置15min，12,000rpm(13,400g)离心30-60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB1放入收集管中。7.向吸附柱CB1中加入600l漂洗液PW，12,000rpm(13,400g)离心30-60sec，倒掉收集管中的废液。8重复操作步骤11。9将吸附柱CB1放入收集管中，12,000rpm(13,400g)离心2min，尽量除去漂洗液。将吸附柱置于室温放置数分钟，彻底地晾干，以防止残留的漂洗液影响下一步的实验。注意：漂洗液中乙醇的残留会影响后续的PCR实验。10取出吸附柱CB1，放入一个干净的离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加20l洗脱缓冲液EB，室温放置2min。12,000rpm(13,400g)离心2min，收集DNA溶液。,3.DNA甲基化的检测,-重亚硫酸盐转化法(Bisulfiteconversion),3.重亚硫酸盐转化DNA回收,18,.,巢式PCR,富集，特异,3.DNA甲基化的检测,-重亚硫酸盐转化法(Bisulfiteconversion),4.PCR扩增,19,.,甲基化特异的引物设计,3.DNA甲基化的检测,-重亚硫酸盐转化法(Bisulfiteconversion),4.PCR扩增,20,.,体系：2xPCRmix10ulDNA1ulPrimerF0.5ulPrimerR0.5ulH2Oupto20ul,Round1:(外围引物)-以重亚硫酸盐处理后的DNA为模板,3.DNA甲基化的检测,-重亚硫酸盐转化法(Bisulfiteconversion),4.PCR扩增,21,.,Round2:(内围引物)-以第一轮PCR反应产物为模板,体系：2xPCRmix15ulDNA1ulPrimerF0.5ulPrimerR0.5ulH2Oupto30ul,3.DNA甲基化的检测,-重亚硫酸盐转化法(Bisulfiteconversion),4.PCR扩增,22,.,1）配胶，称取0.6g琼脂糖，放入锥形瓶内，加入35mlTAE，轻微晃动，混匀后放入微波炉加热约2min，取出来晃动混匀，再用微波炉加热约30s，放置到室温冷却6-8min，倒入事先准备好的胶槽；（注：琼脂糖一定要充分融化，可对着灯光检查是否还有不透明颗粒检查溶胶效果）2）上样，取5ulPCR扩增产物，加入1ul6xloadingbuffer，混匀后加入琼脂糖凝胶点样孔内，并在样品旁边的点样孔加入6ul100bpDNAmarker；（注：通常将marker点在样品的左边）3）电泳，将电压调至130U，时间为25min，开始电泳