《工业微生物》-第六章PPT课件

.,1,工业微生物,第六章微生物的遗传变异和育种,.,2,第一节微生物遗传的物质基础,微生物的遗传物质是核酸，核酸分为脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA),除少数病毒的遗传物质为RNA外，其余均为DNA。一、遗传物质在微生物细胞内存在的方式核酸作为遗传的物质基础，它具备两个条件：首先能遗传给子代，也就是说子代能从上代获得遗传物质，并能自我复制；再则能指令生物体合成其他物质，使所传送的基因得以表达。那么，核酸是以怎样的形式存在于细胞内呢？下面从几个方面来进行阐述。,.,3,第一节微生物遗传的物质基础,（一）染色体染色体是遗传信息的主要携带者，是由脱氧核糖核酸(DNA)和组蛋白组成。不论是真核细胞还是原核细胞，它们的大部分DNA都集中在细胞核或核区（核质体）中。但真核细胞的细胞核有核膜包裹，形态固定的真核，核内DNA与组蛋白结合在一起形成一种在光学显微镜下能见的核染色体；而原核细胞只有无核膜包裹的呈松散状态存在的核区，其中的DNA呈环状双链结构，不能与任何蛋白质,.,4,第一节微生物遗传的物质基础,相结合。不论真核微生物的细胞核还是原核微生物细胞的核区都是该微生物遗传信息的大本营和信息库，因此被称为核基因组、核染色体组或简称基因组。再从细胞内的染色体数目来看，不同的微生物的染色体数目差别很大，真核微生物常有较多的染色体，如酵母菌属中有的种有17条之多，而原核微生物中常只有一条裸露的环状DNA大分子核酸，即一条染色体。,.,5,第一节微生物遗传的物质基础,（二）核酸核酸是由数十个至数以万计的单核苷酸聚合而成的生物大分子。在真核微生物中，DNA总是与缠绕的组蛋白同时存在的，而原核微生物的DNA都是单独存在的。从核酸的组成、结构和长度来看，不管是DNA还是RNA，绝大多数是双链的。此外，同是双链DNA，其存在状态有的呈环状（如原核微生物和部分病毒），有的呈线状（如部分病毒），而有的则呈麻花状（如细菌质粒）。而对于DNA长度（基因组的大小），不同的微生物其基因组大小的差别很大。一般可用bp（碱基对）、kb（千碱基对）和Mb（兆碱基对）作单位。,.,6,第一节微生物遗传的物质基础,（三）基因和密码子基因是生物体内具有自主复制能力的最小遗传功能单位。基因的实质是一条具有特定核苷酸序列的核酸分子片段。染色体是由众多基因所构成的。每个基因大体在10001500bp的范围，相对分子质量约为6.7105。有关基因的概念和种类是遗传学中内容最丰富、发展最迅速的热点之一。遗传密码是指DNA链上各个核苷酸的特定排列顺序。遗传密码的信息单位是密码子，每个密码子是由三个核苷酸顺序即1个三联体所组成，它是负载遗传信息的基本单位。,.,7,第一节微生物遗传的物质基础,（四）核苷酸各种遗传密码子储存着各自对应的信息，而单个核苷酸或碱基则是密码子的组成单位，是基因突变的最小单位。从绝大多数微生物的DNA组分来看，其分别由腺苷酸、胸苷酸、鸟苷酸和胞苷酸4种脱氧核苷酸组成。其上的碱基分别为腺嘌呤（A）、胸腺嘧啶（T）、鸟嘌呤（G）和胞嘧啶（C）。,.,8,第一节微生物遗传的物质基础,二、DNA的结构与复制（一）DNA的结构1953年，Watson和Crick首先提出DNA的结构模型，认为DNA是由两条反向平行的多核苷酸组成的双螺旋结构，两条多核苷酸链通过碱基间的氢键相结合。此结构已经扫描隧道显微镜所证实。,.,9,第一节微生物遗传的物质基础,（二）DNA的复制在细胞分裂和传代的过程中，作为微生物遗传物质的DNA必须准确无误地复制，才能使子代细胞含有相同的遗传信息，以保持物种的稳定。1958年，Meselson和Stahl用15N标记的碱基培养大肠杆菌，并定时取样分离DNA，进行密度梯度离心。研究结果证明，DNA是以独特的半保留方式进行复制的，即每一子代DNA分子的一条链来自亲代，另一条链是新合成的。,.,10,第一节微生物遗传的物质基础,三、基因表达在所有的生物中，基因的主要功能是把遗传信息转变为特定氨基酸顺序的多肽，从而决定生物性状的过程，这一过程称为基因表达。基因表达包括以下两个步骤，首先以DNA为模板，通过RNA聚合酶转录出mRNA（信使RNA），然后将mRNA的碱基顺序翻译成由相应氨基酸顺序组成的蛋白质（图6-1)。,.,11,第一节微生物遗传的物质基础,.,12,第一节微生物遗传的物质基础,由此可见，DNA是间接控制着蛋白质的合成，即由信使RNA（mRNA）作中间媒介。mRNA是在核内或核区中以DNA为模板，在依赖于DNA的RNA多聚酶的参与下合成的。mRNA全盘转录了DNA的全套信息。而在参与蛋白质合成的翻译过程中，则以信使RNA为模板，在核糖体上由tRNA携带特定氨基酸到核糖体上与其上所附着的mRNA分子的密码子一一对号入座。从而将一个个氨基酸在核糖体上以信使RNA的信息翻译成氨基酸的序列，直至终止密码为止，多肽从核糖体上脱下来，形成具有活性的蛋白质分子。,.,13,第二节菌种分离,自然界中微生物资源极其丰富，土壤、水、空气、动植物及其腐败残骸都是微生物的主要栖居和生长繁殖场所。微生物种类之多，至今仍是一个难以估测的未知数。从微生物的营养类型和代谢产物及其能在各种极端环境条件（高热、高压、低温、强碱、强酸及高渗透压等）下生存的角度分析，微生物种类应大大超过所有动植物之和。随着微生物学研究工作的不断深入，微生物菌种资源开发和利用的前景十分广阔。新的微生物菌种需要从自然生态环境中混杂的微生物群中挑选出来，因此必须要有快速而准确的新种分离和筛选方法。典型的微生物新种分离筛选的具体过程大体可分为采样、增殖、纯化和性能测定等步骤。,.,14,第二节菌种分离,一、采样采样就是从自然界中采集含有目的菌的样品。采样应根据筛选的目的、微生物分布情况、菌种的主要特征及其生态关系等因素，确定具体的时间、环境和目标物。土壤是微生物的大本营，土壤中微生物的数量和种类受土壤的营养环境、土壤表面的植被、温度、湿度、通风情况、养分、水分、酸碱度和光照等多种因素的影响，故在采样时应予以重视。,.,15,第二节菌种分离,土壤的营养环境影响微生物数量和种类的分布。一般菜园和耕作层土壤是有机质较多的土层，常以细菌和放线菌为主；果园树根土层中，酵母菌含量较高；动植物残体及霉腐土层中，分布着较多的霉菌。此外，河流湖泊的淤泥中能分离到产甲烷菌；油田和炼油厂周围土层中常见分解石油的微生物等。土壤的植被情况与微生物的类型有着一定的关系。如豆科植物根系土中，往往存在着根瘤菌；瓜田、果树下的土壤中酵母菌较多。,.,16,第二节菌种分离,土壤的深度不同，其通风、养分、水分、光照等情况就不同，表层土由于日光直接照射，水分较少，不利于微生物生长，所以微生物数量较少，一般离表层515cm深处的土层含微生物最多。季节和温湿度对微生物的生长也有很大的影响。由于春秋季节温度、湿度对微生物的生长繁殖最合适，因此，土壤中微生物数量最多，所以春秋两季适合于采样。,.,17,第二节菌种分离,采集土样时，应在选好适当的地点后，用不锈钢采样铲去除表土，取离地面515cm处的土样几十克，盛于预先灭菌的牛皮纸袋、塑料袋或玻璃瓶中，密封好，并标明时间、地点和环境情况等，以备查考。各种水体也是工业微生物菌种的重要来源，许多具有光合作用能力的微生物及兼性或专性厌氧微生物都能从各种水体中筛选得到。,.,18,第二节菌种分离,二、增殖在采集的样品中，一般待分离的菌种在数量上并不占优势，为提高分离的效率，可以对采集到的样品进行一次甚至多次增殖培养。增殖培养也称富集培养，就是在培养基中投放和添加特殊的养分或抗菌物质，使所需菌种的数量相对增加。其实质是使天然样品中的劣势菌转变为人工环境中的优势菌，便于将它们从样品中分离。,.,19,第二节菌种分离,三、纯化增殖培养的结果并不能获得微生物的纯种。即使在增殖培养过程中设置了许多限制因素，但其他微生物并没有死去，只是数量相对减少，一旦遇到适宜条件就会快速生长繁殖。故增殖后得到的微生物培养物仍是一个各类微生物的混合体。为了获得某一特定的微生物菌种，必须进行微生物的纯化即纯培养。,.,20,第二节菌种分离,常用的菌种纯化方法很多，大体可将它们分为二个层次：一个层次较粗放，一般只能达到“菌落纯”的水平，从“种”的水平来说是纯的，其方法有划线分离法，涂布分离法和稀释分离法。划线分离法简便而快速，即用接种针挑取微生物样品在固体培养基表面划线，适当条件下培养后，获得单菌落；涂布分离法与划线法类似，用涂布棒蘸取培养液，或先将少量培养液滴在固体培养基表面，再用涂布棒在固体培养基表面均匀涂布；稀释分离法所获得的单菌落更加分散均匀，获得纯种的机率较大。该法是将降至60左右的固体培养基与少量培养液混匀后，再浇注成平板以获取单菌落。,.,21,第二节菌种分离,另一层次是较为精细的单细胞或单孢子分离法，它可达到细胞纯即菌株纯的水平。这种方法的具体操作方法很多，最简便的方法是利用培养皿或凹玻片等分离小室进行细胞分离。也可以利用复杂的显微操作装置进行单细胞挑取。如果遇到不长孢子的丝状菌，则可用无菌小刀切取菌落边缘疏稀的菌丝尖端进行分离移植，也可用无菌毛细管插入菌丝尖端，以获取单细胞。在具体的工作中，究竟采取哪种方法，应视微生物的实际情况和实验条件而定。为了提高分离筛选工作的效率，除增殖培养时，应控制增殖条件外，在纯种分离时，也应控制适宜的培养条件，并选用特异的检出方法和筛选方案。,.,22,第二节菌种分离,四、筛选筛选是对分离获得的纯培养菌株进行生产性能的测定，从中选出适合生产要求的菌株。在菌种纯化过程中能获得大量的目标菌株，它们都具备一些共性，但只有经过进一步的筛选，才能确定哪些菌株更符合生产要求。筛选分为初筛和复筛两步：初筛以量为主，对所有分离菌株进行粗略的生产性能测试；复筛以质为主，对经初筛所获得的少量生产潜力较大菌株进行比较精确的生产性能测试。,.,23,第三节基因突变和诱变育种,微生物菌种的选育是建立在遗传和变异基础上的。基因突变是微生物变异的主要源泉。人工诱变又是加速基因突变的重要手段。以人工诱变为基础的微生物诱变育种，具有速度快、收效大、方法简单等优点，它是菌种选育的一个重要途径，在发酵工业菌种选育上具有卓越的成就，迄今为止国内外发酵工业中所使用的生产菌种绝大部分是人工诱变选育出来的。诱变育种在抗生素工业生产上的作用更是无可比拟，几乎所有的抗生素生产菌都离不开诱变育种的方法。我国微生物工业的发展，是与菌种的选育工作的发展紧密联系的。随着菌种选育取得重要的成就，发酵工业的生产也得以迅速的发展、扩大和提高。,.,24,第三节基因突变和诱变育种,一、基因突变基因突变是最基本的遗传变异现象之一。由于微生物内部因素和自然环境的影响，遗传物质在不断地发生变异，同时微生物本身还具有对基因突变的修复能力，从而保持了物种的稳定性。,.,25,第三节基因突变和诱变育种,（一）突变的概念基因突变简称突变，是变异的一类，泛指细胞内（或病毒颗粒内）遗传物质的分子结构或数量突然发生的可遗传的变化。狭义的突变专指基因突变，也称点突变；而广义的突变分为染色体畸变和基因突变。突变的概率一般很低，约为10-610-9。从自然界分离到的菌株一般称野生型菌株，简称野生型。野生型经突变后产生的带有新性状的菌株称突变型菌株，简称突变株、突变体或突变型。突变是工业微生物产生变种的根源，是选种育种的基础，但也是菌种发生退化的主要原因。所以自然界形形色色的菌种是生物长期进化，即通过变异和自然选择的结果。,.,26,第三节基因突变和诱变育种,（二）突变型的类型表型是指具有一定遗传型的生物体，在特定环境条件下通过生长发育所表现出来的一切外表特征和内在特性的总和。基因突变的类型很多，从筛选菌株的实用目的出发，按突变体表型特征的不同，可把突变分成以下几种类型。,.,27,第三节基因突变和诱变育种,1形态突变型形态突变型是指由突变引起的个体形态或菌落形态的变异。如细菌的鞭毛、芽孢或荚膜的有无，霉菌或放线菌的孢子有无或颜色变化，菌落的大小，菌落表面的光滑、粗糙，以及噬菌斑的大小或清晰度等的突变。,.,28,第三节基因突变和诱变育种,2营养缺陷型野生型菌株因发生基因突变而丧失合成一种或几种生长因子、碱基或氨基酸的能力，因而无法再在基本培养基上正常生长繁殖，只能在补充了相应生长因子的补充培养基上或在含有天然营养物质的完全培养基上才能生长的变异类型，称为营养缺陷型。营养缺陷型突变株在遗传学、分子生物学、遗传工程和工业微生物育种等工作中有着重要的应用。,.,29,第三节基因突变和诱变育种,3抗性突变型指野生型菌株因发生基因突变而产生的对某种化学药物、致死物理因素或噬菌体具有抗性的变异类型。根据其抵抗的对象可分为抗药性突变型、抗紫外线突变型或抗噬菌体突变型等。它们十分常见且极易分离，一般只需要在含抑制生长浓度的某药物、相应的物理因素或在相应噬菌体平板上涂上大量的敏感细胞群体，经一定时间培养后即可获得。抗性突变型在遗传学基本理论的研究中十分有用，它常作为选择性标记菌株。,.,30,第三节基因突变和诱变育种,4致死突变型致死突变型是指由于基因突变而造成菌体死亡的突变类型。通常可分为显性致死和隐性致死，杂合状态的显性致死和纯合状态的隐性致死都会导致个体的死亡。在单倍体生物中两种类型都会引起个体的死亡。,.,31,第三节基因突变和诱变育种,5条件致死突变型突变后的菌体在某种条件下可以正常地生长、繁殖并呈现其固有的表型，而在另一种条件下则发生死亡，这种突变型称为条件致死突变型。温度敏感突变型是最典型的条件致死突变型。有些菌体发生突变后对温度变得敏感了，在较窄的温度范围内才能存活，超出此温度范围则死亡。其原因是突变使某些重要蛋白质的结构和功能发生改变，以致会在某特定温度下具有的功能，而在另一温度下则无此功能。如有些大肠杆菌突变菌株能在37下生长，但不能在42下生长；噬菌体T4的几个突变株在25下有感染力，而在37下则失去感染力。,.,32,第三节基因突变和诱变育种,6产量突变型通过基因突变而产生的在代谢产物产量上明显有别于原始菌株的突变株称为产量突变型。若产量显著高于原始菌株的称为正变株；而把产量显著低于原始菌株的称为负变株。筛选高产正变株的工作对生产实践极为重要，但由于产量高低是由多个基因决定的，因此在育种实践上，只有把诱变育种与重组育种和遗传工程育种很好的结合起来，才能取得良好的效果。,.,33,第三节基因突变和诱变育种,（三）突变的类型根据突变涉及的范围，可以把突变分为染色体畸变和基因突变。1染色体畸变染色体畸变指的是染色体结构的改变，包括缺失、重复、倒位和易位等。缺失指的是染色体片段的丢失；重复是指染色体片段的二次出现；倒位是指染色体的片段发生了180的位置颠倒；易位则是指一个染色体的一个片段连接到另一个非同源染色体上。如果是两个非同源染色体之间相互交换了部分片段则称相互易位。图6-2中每组线的上面一条染色体是正常的，下面一条染色体是发生畸变的。,.,34,第三节基因突变和诱变育种,图6-2常见的几种染色体畸变1缺失；2重复；3倒位；4相互易位,.,35,第三节基因突变和诱变育种,2基因突变基因突变也称点突变，指的是染色体局部点位内的变化，涉及一对或少数几对核苷酸的增加、减少或替换。（1）碱基置换在DNA链上的碱基序列中一个碱基被另一个碱基代替的现象称为置换。碱基置换分为两种类型：一类称为转换，是指DNA链中嘌呤与嘌呤（A与G）之间或嘧啶与嘧啶（T与C）之间发生互换；另一类为颠换，是指DAN链中一个嘌呤被一个嘧啶或一个嘧啶被一个嘌呤所替换（图6-3）。,.,36,第三节基因突变和诱变育种,.,37,第三节基因突变和诱变育种,（2）移码突变在DNA序列中由于一对或少数几对核苷酸的插入或缺失而使其后全部遗传密码的阅读框架发生移动，进而引起转录和翻译错误的突变叫移码突变（图6-4）。由移码突变所产生的突变株，称为移码突变株。移码突变只属于DNA分子的微小损伤，其结果只涉及有关基因中突变点后面的遗传密码阅读框架发生错误。,.,38,第三节基因突变和诱变育种,.,39,第三节基因突变和诱变育种,（四）基因突变的机制基因突变的机制是多样性的，按突变的条件和原因划分，可分为自发突变和人工诱发突变两大类。1自发突变自发突变是指微生物在无人工干预下自然发生的突变。引起自发突变的原因很多，一般有：（1）背景辐射和环境因素如宇宙间的短波辐射、紫外线及高温、病毒等。这些因素多为环境中自然存在的一些低剂量的物理、化学诱变因素。随着环境的恶化、臭氧层的减薄，这些因素的作用日渐加强。,.,40,第三节基因突变和诱变育种,（2）微生物自身有害代谢产物的诱变如过氧化氢是微生物的一种正常代谢产物，它对脉孢菌具有诱变作用。它可因同时加入过氧化氢酶而降低突变率，如果再同时加入过氧化氢酶抑制剂，则又可提高突变率。由此可说明过氧化氢可能是自发突变中的一种内源诱变剂。除过氧化氢外，咖啡碱、硫氰化物、二硫化二丙烯、重氮丝氨酸等，微生物所产生的这些物质同样会作用于DNA分子，引发突变。,.,41,第三节基因突变和诱变育种,（3）由DNA复制过程中的碱基错误配对所引起据统计，在DNA分子的复制过程中，每个碱基错误配对发生的频率为10-710-11，而一个基因的平均长度约为1000bp，故由于碱基错误配对引起的自发突变率约为10-410-8。因此，若对细菌做一般液体培养时，因其细胞浓度常可达到108个/mL，故经常会在其中产生自发突变株。,.,42,第三节基因突变和诱变育种,2诱发突变诱发突变简称诱变，是指通过人为的方法，利用物理、化学和生物因素处理微生物而引起的突变。将这些能使突变率提高到自发突变水平以上的物理、化学和生物因素统称为诱变剂。诱发突变与自发突变在效应上几乎没有差异，突变基因的表现型和遗传规律在本质上也是相同的。只是与自发突变相比，诱发突变速度快、时间短、突变频率高。诱发突变在工业微生物菌种选育与改造方面已经取得了惊人的效果。,.,43,第三节基因突变和诱变育种,（1）物理诱变利用物理因素引起基因突变的称为物理诱变。物理诱变因素很多，有非电离辐射类的紫外线、激光和离子束等；有能够引起电离辐射的X射线、射线和快中子等。诱变育种工作中常用的有紫外线和射线等。,.,44,第三节基因突变和诱变育种,紫外线是波长范围为136390nm的射线，它是一种非电离辐射。紫外线波长虽较宽，但诱变有效范围是200300nm，其中又以260nm左右效果最好。各种微生物对紫外线的敏感性是不相同的，有些甚至差异很大。一般诱变用15W低功率的紫外灯，而高功率紫外灯，由于放出的光谱分布比较均匀，范围较宽，因此效果不如低功率的紫外灯。紫外线诱变育种已沿用多年，目前仍普遍使用，育种效果比较好，操作方便。例如糖化酶产生菌黑曲霉变异株的出发菌株产酶不到1000U/mL，经过紫外线诱变选育后的突变株，产量提高到3000U/mL。,.,45,第三节基因突变和诱变育种,（2）化学诱变利用化学物质对微生物进行诱变，引起基因突变的称为化学诱变。通过对上千种化学物质的诱变作用进行研究，发现从简单的无机物到复杂的有机物，包括金属离子、一般试剂、生物碱、生长刺激素、抗生素、农药、灭菌剂、色素、染料等，都可以诱发突变，但是诱变效果好的种类并不多。根据化学诱变剂对DNA作用方式的不同，可以将它们分为以下三类。,.,46,第三节基因突变和诱变育种,第一类是能够改变DNA化学结构的诱变剂，如亚硝酸和烷化剂等。亚硝酸具有氧化脱氨作用，它能使腺嘌呤(A)脱去氨基变成次黄嘌呤(H)，胞嘧啶(C)脱去氨基变成尿嘧啶(U)。在DNA分子第一次复制时，H与C配对，U与A配对。第二次复制时，C与G配对，A与T配对。于是，经过两次复制，原来的AT碱基对就变成了GC碱基对，而GC碱基对却变成了AT碱基对。,.,47,第三节基因突变和诱变育种,常见的烷化剂有硫酸二乙酯、乙烯亚胺、甲基磺酸乙酯、亚硝基甲基脲等。烷化剂有一个或几个不稳定的烷基，能够与DNA分子的碱基发生化学反应，置换其中某些基团的氢原子，从而改变碱基的化学结构，使DNA分子复制时出现碱基配对的差错，最终导致基因突变。,.,48,第三节基因突变和诱变育种,第二类是碱基类似物，是指与DNA的四种碱基A、T、G、C在化学结构上相似的一类物质。在DNA分子复制时，这些碱基类似物能够作为DNA的组成成分加入到DNA分子中，从而引起基因突变。常见的碱基类似物有5溴尿嘧啶和5-溴脱氧尿核苷（是胸腺嘧啶结构类似物），2氨基嘌呤（是腺嘌呤的结构类似物）等。第三类是移码诱变剂，它们可以插入DNA分子结构中，使DNA分子在复制或转录时出现差错而导致突变。如吖啶类化合物、溴化乙锭和一系列“ICR”类化合物。,.,49,第三节基因突变和诱变育种,（六）基因突变的特点由于所有微生物的遗传物质的化学本质都是核酸，除部分病毒的遗传物质为RNA外，绝大部分为DNA。因此，在遗传变异特性上都遵循着共同的规律，这在基因突变水平上非常明显。基因突变具有以下特点：,.,50,第三节基因突变和诱变育种,1基因突变的自发性及不对应性各种性状的突变都可以在没有任何人为诱变因素的作用下自发产生，这就是基因突变的自发性。基因突变的性状与引起突变的因素之间无直接的对应关系。就是说，在紫外线诱变下可以出现抗紫外线菌株，通过自发或其他诱发因素也可以获得同样的抗紫外线菌株。,.,51,第三节基因突变和诱变育种,2基因突变的稀有性虽然自发突变随时都可能发生，但自发突变发生的概率是很低的，一般在10-610-9之间。3基因突变的独立性突变对每个细胞是随机的，对每个基因也是随机的。每个基因的突变是独立的，既不受其他基因突变的影响，也不会影响其他基因的突变。,.,52,第三节基因突变和诱变育种,4基因突变的可诱变性通过人为的诱变剂作用，可以提高菌株的突变率，一般可以将突变率提高10105倍。因为诱变剂仅仅是提高突变率，所以自发突变与诱发突变所获得的突变株并没有本质区别。5基因突变的稳定性因为基因突变的原因是遗传物质的结构发生了变化，所以突变产生新的变异性状是稳定的，也是可遗传的。6基因突变的可逆性由原始的野生型基因变异成为突变型基因的过程称为正向突变，相反的过程称为回复突变。实验证明，任何遗传性状都可发生正向突变，也可发生回复突变。,.,53,第三节基因突变和诱变育种,二、诱变育种诱变育种是指利用物理或化学等因素处理微生物细胞，提高基因的随机突变频率，通过一定的筛选方法获得所需要的高产优质菌株。诱变育种在工业微生物育种上有多种用途。首先，通过诱变育种能提高产物的产量，即可以获得高产突变株。其次，通过诱变育种可以改善菌种特性、提高产品质量、扩大品种和简化生产工艺，降低成本。由于诱变育种具有方法简单、快速和收效显著等特点，故仍是目前被广泛使用的主要育种方法之一。,.,54,第三节基因突变和诱变育种,诱变育种的基本步骤包括：出发菌株的选择，菌株的培养，菌悬液的制备，诱变处理，中间培养，突变株的分离与筛选等。1出发菌株的选择诱变育种的目的是提高产物的产量，改进产品的质量或改变原有的代谢途径，产生新的代谢产物。那么，选好出发菌株对提高诱变效果有着极其重要的意义。用作诱变育种的出发菌株常有以下几类。,.,55,第三节基因突变和诱变育种,从自然界分离的野生型菌株。这类菌株虽然产量较低，但对诱变因素敏感，变异幅度大，正突变率高。选取生产中由于自发突变或长期在生产条件下驯化而筛选得到的菌株，与野生型菌株较相象，容易达到较好的诱变效果。,.,56,第三节基因突变和诱变育种,选取每次诱变处理都有一定提高的菌株。这类菌株在育种工作中经常采用。对于这类菌株，由于情况比较复杂，必须根据情况，区别对待。一般认为最合理的做法是在每次诱变处理后选取35个较高产的菌株作为出发菌株，继续诱变。如果是产量特别高的菌株，可先行重组育种，再作为诱变的出发菌株，就有可能得到好的效果。总之，在诱变育种的实际工作中，如何选择一个好的出发菌株，不仅要积累很多实际经验，而且还需要和诱变方法密切配合，才能得到好的结果。,.,57,第三节基因突变和诱变育种,2菌株的培养在诱变育种中，处理材料一般采用生理状态一致的单倍体、单核细胞，即菌悬液的细胞应尽可能达到同步生长状态，这称为同步培养。细菌一般要求培养至对数生长期，此时群体生长状态比较同步，比较容易变异，重复性较好。如亚硝基胍诱变时作用于复制叉处，生长旺盛的细胞中复制叉点较多，碱基类似物也在此时期比较容易进入DNA链中。霉菌处理使用分生孢子，应该将分生孢子在液体培养基中短时间培养，使孢子孵化，处于活化状态，并恰好未形成菌丝体，易于诱变。,.,58,第三节基因突变和诱变育种,3菌悬液的制备为使每个细胞均匀接触诱变剂并防止长出不纯菌落，就要求作诱变的菌株必须以均匀而分散的单细胞悬液状态存在。由于某些微生物细胞是多核的，即使处理其单细胞，也会出现不纯菌落；又由于一般DNA都是以双链状态存在的，而诱变剂通常仅作用于某一单链的某一序列，因此，突变后的性状往往无法反映在当代的表型上，而是要通过DAN的复制和细胞分裂后才表现出来，于是出现了不纯菌落。上述两类不纯菌落的存在，也是诱变育种工作中初分离的菌株经传代后会很快出现生产性状“退化”的原因之一。鉴于以上原因，用于诱变育种的细胞应尽量选用单核细胞，如霉菌或放线菌的分生孢子或细菌的芽孢等。,.,59,第三节基因突变和诱变育种,菌悬液是直接供诱变处理的，其质量的好坏将直接影响诱变效果。菌悬液一般可用生理盐水或缓冲溶液配制，如果是用化学诱变剂处理，因处理时pH会变化，必须要用缓冲溶液。除此之外，还应注意分散度，方法是先用玻璃珠振荡分散，再用脱脂棉或滤纸过滤，经处理，分散度可达90以上。这样，可以保证菌悬液均匀地接触诱变剂，获得较好诱变效果。最后制得的菌悬液，霉菌孢子或酵母菌细胞的浓度大约为106107个mL，放线菌和细菌的浓度大约为108个mL。菌悬液的细胞数可用平板计数法、血球计数板或光密度法测定，但以平板计数法较为准确。,.,60,第三节基因突变和诱变育种,4诱变处理诱变处理包括诱变剂的选择和使用剂量的确定。各种诱变剂都有其各自作用的特殊性，但由于目前对绝大多数微生物所呈现各种性状的相应基因了解的还很不够，所以在选择诱变因素的时候，需作大量的预备性试验。在实际的工作中，一般都先采用一些效果好的诱变剂，如化学因素中的甲基磺酸乙酯，用它处理棒杆菌和枯草杆菌，处理时间延长至18h，在存活率为1.010-7时，突变率达82.7%；处理黑曲霉67h，存活率在0.01%以下时，营养缺陷型多达3%以上。就物理诱变因素而言，目前使用较多的是紫外线和射线等。,.,61,第三节基因突变和诱变育种,要确定一个合适的剂量，通常要经过多次试验，就一般微生物而言，诱变频率往往随剂量的增大而增大，但达到一定剂量后，再提高剂量会使诱变频率下降。根据对紫外线、射线及乙烯亚胺等诱变剂诱变效应的研究，发现正突变较多地出现在较低的剂量中，而负突变则较多地出现在高剂量中，同时还发现经多次诱变而提高产量的菌株中，高剂量更容易出现负突变。因此，在诱变育种工作中，目前较倾向于采用较低剂量。,.,62,第三节基因突变和诱变育种,在诱变育种时，有时可根据实际情况，采用多种诱变剂复合处理的办法。复合处理方法主要有三类：a.两种或多种诱变剂先后使用；b.同一种诱变剂的重复使用；c.两种或多种诱变剂的同时使用。如果能使用不同作用机制的诱变剂来做复合处理，可能会取得更好的诱变效果。诱变剂的复合处理常呈现一定的协同效应，这对诱变育种的工作是很有价值的。,.,63,第三节基因突变和诱变育种,5中间培养对于刚经诱变剂处理过的菌株，有一个表现迟滞的过程，需3代以上的繁殖才能将突变性状表现出来。据此应让变异处理后细胞在液体培养基中培养几小时，使细胞的遗传物质复制，繁殖几代，以得到纯的变异细胞。这样，稳定的变异就会显现出来。若不经液体培养基的中间培养，直接在平皿上分离就会出现变异和不变异细胞同时存在于一个菌落内的可能，形成混杂菌落，以致造成筛选结果的不稳定和将来的菌株退化。,.,64,第三节基因突变和诱变育种,6突变株的分离和筛选经过中间培养，分离出大量的较纯的单个菌落，接着，要从几千万个菌落中筛选出几个所谓性能良好的正突变菌株，这将要花费大量的人力和物力。怎样设计才能花费较少的工作量达到最好的效果，这是筛选工作中的一条原则。一般采用一些方法加以简化，如利用形态突变直接淘汰低产变异菌株，或利用平皿反应直接挑取高产变异菌株等。平皿反应是指每个变异菌落产生的代谢产物与培养基内的指示物在培养基平板上作用后表现出一定的生理效应，如变色圈、透明圈、生长圈、抑菌圈等，这些效应的大小表示变异菌株生产活力的高低，以此作为筛选的标志。常用的方法有纸片培养显色法、透明圈法、琼脂块培养法等。,.,65,第四节基因重组和杂交育种,微生物变异是由于遗传物质的成分和结构的改变引起的。遗传物质的这些改变，可以通过突变发生在一个细胞内部，也可以通过两个细胞间遗传物质的重组而实现。将二个不同性状个体内的基因转移到一起，经过重新组合后，形成新的遗传型个体的过程称为基因重组。基因重组是生物体在未发生突变的情况下，产生新的遗传型个体的现象。,.,66,第四节基因重组和杂交育种,杂交育种一般是指人为利用真核微生物的有性生殖、准性生殖，或原核微生物的接合、转导和转化等过程，促使两个具有不同遗传性状的菌株发生基因重组，以获得性能优良的生产菌株。尽管一些优良菌种的选育主要是采用诱变育种的方法，但是某一菌株长期使用诱变剂处理后，其生活能力一般要逐渐下降，如生长周期延长、孢子量减少、代谢减慢、产量增加缓慢、诱变因素对产量基因影响的有效性降低等。因此，需采用杂交育种的方法进一步优化菌株；另外，由于杂交育种是选用已知性状的供体和受体菌种作为亲本，因此不论在方向性还是自觉性方面，都比诱变育种前进了一大步，所以它是微生物菌种选育的一种重要的方法。,.,67,第四节基因重组和杂交育种,一、原核微生物的基因重组原核微生物缺乏有性生殖系统，在进行基因重组时，它们的两个亲本细胞并不给子代提供等量的遗传信息，彼此间能互相交换小部分的遗传信息，通常称提供交换DNA的原核微生物为供体，而获得DNA的原核微生物为受体。原核微生物的基因重组可以通过转化、转导和接合等方式进行。以下主要介绍转化及转导两种重组方式。,.,68,第四节基因重组和杂交育种,1转化受体细胞从周围介质中吸收来自供体细胞的DNA片段（常称为转化因子），并把它整合到自己的基因组中，从而获得新的遗传性状的现象，称转化。经转化所得的供体性状的子代叫转化子。转化主要通过3个步骤完成，如图6-5所示。,.,69,第四节基因重组和杂交育种,.,70,第四节基因重组和杂交育种,（1）感受态细胞的建立只有处于感受态的细胞才能作为转化的受体。所谓的感受态是指细胞能够从周围环境中吸收DNA分子片段进行转化的生理状态。感受态的出现与菌株的遗传特性和培养条件等因素有关。不同的菌株感受态持续的时间也不同，如枯草芽孢杆菌可持续几个小时，而肺炎双球菌只能持续几分钟。现在人们也可以用人工的方法提高受体菌感受态的水平，如用cAMP处理嗜血杆菌细胞群体可使其感受态水平提高1万倍。,.,71,第四节基因重组和杂交育种,（2）转化因子的吸附和吸收首先是供体双链DNA与受体细胞壁上的吸附位点相结合。对于不同的受体细胞而言，其细胞壁上的吸附位点数是不同的，而且对转化因子吸附的专一性也不同。如肺炎双球菌上的位点数有3080个，而且肺炎双球菌对于转化因子的吸附没有专一性；流感嗜血杆菌上的位点数则有410个，并且具有高度的专一性，只能吸附同种不同菌株的DNA，不能吸附大肠杆菌的DNA。随后其中一条DNA链被细胞表面上的核酸酶降解，降解产生的能量协助把另一条DNA链推进受体细胞。到目前为止，亦发现有完整的双链被摄取的情况，如革兰氏阴性菌嗜血杆菌。,.,72,第四节基因重组和杂交育种,（3）转化因子的整合与转化子的形成当单链转化因子DNA进入受体细胞后，便与双链结构的受体染色体DNA同源片段配对，接着受体染色体DNA上的相应单链片段被切除，并被转化因子DNA交换、整合和替换。被替换下来的受体染色体DNA片段被酶所降解，缺口部分被修复合成及连接，形成部分杂合双链，再通过DNA复制和细胞分裂即得重组子代，经选择性培养基分离可获得转化子。,.,73,第四节基因重组和杂交育种,能够发生转化的微生物有许多，如肺炎链球菌属、嗜血杆菌属、芽孢杆菌属、假单胞杆菌属、奈瑟氏球菌属、葡萄球菌属和根瘤菌属等。转化性状也多样，如形态、荚膜物质、糖发酵、耐药性、抗原性、致病力、代谢产物、营养需要等性状的变化。,.,74,第四节基因重组和杂交育种,2转导通过完全缺陷或部分缺陷噬菌体为媒介，把供体细胞的DNA片段携带到受体细胞中，通过交换与整合，从而使后者获得前者部分遗传性状的现象，称为转导。获得部分新性状的受体细胞，称为转导子。转导可分为普遍性转导和局限性转导两种类型。在普遍性转导中，噬菌体可以转导供体染色体的任何部分到受体细胞中；而在局限性转导中，噬菌体总是携带同样的片段到受体细胞中。,.,75,第四节基因重组和杂交育种,二、真核微生物的基因重组在真核微生物中，基因重组的方式很多，主要有有性杂交和准性杂交两种。1有性杂交杂交是指在细胞水平上进行的一种遗传重组方式。有性杂交，一般是指不同遗传型的两性细胞间发生的接合和随之进行的染色体重组，进而产生新的遗传型后代的一种育种方式。凡能产生有性孢子的酵母菌或霉菌都有与动植物类似的有性杂交现象。现以工业上常用的酿酒酵母为例来加以介绍。,.,76,第四节基因重组和杂交育种,酿酒酵母有其完整的生活史（图6-6）。从自然界分离到的或在工业生产中应用的菌株，一般都是双倍体细胞。把不同生产性状的甲、乙两个亲本菌株（双倍体）分别接种到产孢子培养基斜面上，使其产生子囊孢子（单倍体）。经洗涤、去壁和涂布而得到单倍体菌落。把来自不同亲本、不同性别的单倍体细胞通过离心等方式使之密集地接触，就有更多的机会出现种种双倍体的有性杂交后代。它们的双倍体细胞和单倍体细胞有明显的差别，易于识别（表6-1）。在这些双倍体杂交子代中，通过筛选，就可以选到优良性状的杂种。,.,77,第四节基因重组和杂交育种,.,78,第四节基因重组和杂交育种,.,79,第四节基因重组和杂交育种,2准性杂交准性生殖是部分真菌中存在的不通过减数分裂而产生低频率的基因重组的特殊方式。它包括异核体的形成、体细胞双倍体的产生和细胞在有丝分裂过程中的染色体交换与单倍体化，这三个过程在准性生殖过程中是相互关联的，各阶段的发生与产物形成的频率都对基因重组有很大影响。准性生殖对一些没有有性生殖过程但有重要生产价值的半知菌类育种工作来说，提供了一个杂交育种的手段。现将灰黄霉素生产菌荨麻青霉的准性杂交育种方法简介如下（图6-7）。,.,80,第四节基因重组和杂交育种,.,81,第四节基因重组和杂交育种,（1）选择亲本由于荨麻青霉不产生有性孢子，只有在极个别的体细胞间才发生菌丝联结，而且联结后的细胞在形态上并无显著的特征可寻，因此，必须借助于营养缺陷型这类绝好的选择性标记作为准性杂交亲本的筛选指标，如图6-7中的A-B+和A+B-。（2）强制异合用人为的方法强制A-B+和A+B-菌株所产生的分生孢子（约106107）混合形成异核体。用基本培养基-来检测由A-B+和A+B-体细胞联结所形成的异核体或杂合二倍体菌落。,.,82,第四节基因重组和杂交育种,（3）移单菌落将平板上长出的单菌落移种到基本培养基-的斜面上。（4）验测稳定性利用夹层法检测获得的菌株的稳定性。（5）促进变异把稳定菌株产生的孢子用紫外线、射线等理化因子进行处理，以促使其染色体发生重组交换，经一系列生产性状的测定，就能筛选出优良的准性杂交菌株。,.,83,第四节基因重组和杂交育种,三、基因工程基因工程是指在基因水平上的遗传工程，它是用人为方法将所需要的某一供体生物的遗传物质DNA提取出来，在离体条件下用适当的酶进行切割后，把它与载体DNA分子连接起来形成具有自我复制能力的DNA分子复制子，并将它转移到宿主细胞中扩增和表达。基因工程是20世纪70年代初诞生的一门崭新的生物技术科学。基因工程与当前发展的蛋白质工程、酶工程和细胞工程共同构成了当代新兴的学科领域生物技术工程。生物技术工程的兴起为现代科学技术发展和工农业、医药卫生事业的进步提供了巨大潜力。基因工程操作过程大致可归纳为以下主要步骤：目的基因的获得；载体的选择；目的基因与载体DNA的体外重组；重组载体导入受体细胞以及重组菌的筛选与鉴定（图6-8）。,.,84,第四节基因重组和杂交育种,.,85,第四节基因重组和杂交育种,1目的基因的获得利用各种不同的限制性内切酶切割下人们所需要的基因，也就是某些DNA片段。那里面含有一种或几种遗传信息的全套遗传密码。目的基因的获得是基因工程操作的关键。,.,86,第四节基因重组和杂交育种,2载体的选择载体是携带目的基因并将其转移至受体细胞内复制和表达的运载工具。作为载体DNA分子，应具备以下几个条件。是一个有自我复制能力的复制子。能在受体细胞内大量繁殖，即有较高的复制率。载体上最好只有一个限制性内切核酸酶的切口，使目的基因能固定地整合到载体DNA的一定位置上。载体上必须具有可供选择的遗传标记。,.,87,第四节基因重组和杂交育种,3目的基因与载体DNA的体外重组目的基因用DNA连接酶连接到合适的载体上是DNA重组技术的关键。采用限制性内切核酸酶处理含有酶切点的目的基因DNA分子和载体DNA分子，可使两种DNA分子上产生相同的黏端。所以当两者混合时，凡是与黏端碱基互补的片段，就会因氢键的作用而彼此吸引，重新形成双链。这时，在外界连接酶的作用下，目的基因的DNA与载体的DNA片段之间进行共价连接，形成一个完整的有复制能力的环状重组载体。,.,88,第四节基因重组和杂交育种,4重组载体导入受体细胞上述由体外操纵手续构建成的重组载体，只有将它导入受体细胞内，才能使其中的目的基因获得增殖和表达。把重组载体导入受体细胞有多种途径。如若以重组质粒作为载体时，可以用转化的手段；若以噬菌体作为重组载体时，可以用转导的途径将重组载体导入受体细胞。只是含目的基因的DNA与噬菌体载体的重组DNA分子导入受体细胞，一般先需用噬菌体的蛋白质外壳对重组载体进行体外包装。,.,89,第四节基因重组和杂交育种,5重组受体细胞的筛选和鉴定受体细胞经转化、转导处理后，真正获得目的基因并能有效表达的重组受体细胞一般来说只是一小部分，而绝大部分仍是原来的受体细胞或者是不含目的基因的重组受体细胞。为了得到真正的重组受体细胞，需要对其进行筛选和鉴定。经过筛选所获得的受体细胞就是所谓的“工程菌”。,.,90,第四节基因重组和杂交育种,基因工程育种技术为动植物和微生物间进行任意、定向和超远缘的分子杂交提供了有效方法，从而大大加快了育种的速度。基因工程在工业微生物育种应用中的设想很多，例如通过设计增加控制代谢产物产量的基因拷贝数来大幅度提高产量；将动植物或某些微生物特有产物的控制基因经转化和转导植入细菌细胞而大规模地进行微生物的发酵生产；同时利用“工程菌”在清除污染及以非粮物质为原料进行发酵生产等方面也出现了可喜的突破。,.,91,第四节基因重组和杂交育种,除此以外，基因工程在食品、化工、环保、采矿、冶炼、能源和材料等众多领域的广泛应用，必将在人类实践中发挥重大作用和贡献。当然，它也和其他所有新生事物一样，在它给人们带来巨大利益的同时也面临着严峻的挑战。基因工程与传统生物技术的最根本的区别就在于前者是在基因水平上进行操作，改变已有的基因甚至创造新的物种，这是一项前无古人的崭新工作。因此，基因工程是否具有潜在的危害性，特别是转移至人体的基因是否会激活原癌基因，基因工程是否会导致出现新型病原生物等问题必然也成为人们关心和争议的焦点。但有一点可以肯定，人们既然能发明一种新技术，必然也将会有能力掌握这门新技术，使它朝着有利于人类进步的方向发展。,.,92,第五节菌种的保藏技术,菌种是微生物工作的重要研究对象和材料，是工农业生产的宝贵资源。因此，通过各种技术手段得到的具有优良生产性状的菌种，还必须通过各种保藏技术使其在一定时间内不丢失重要的生物学性状，防止其退化、死亡、被其他微生物污染，或发生变异，使其能长期使用，为人类造福。,.,93,第五节菌种的保藏技术,一、菌种的退化与复壮（一）菌种的退化与防止1菌种退化的现象菌种的退化是指由于自发突变的结果，而使某物种原有的一系列生物学性状发生量变或质变的现象。菌种退化的具体表现有以下几个方面。,.,94,第五节菌种的保藏技术,形态方面，包括分生孢子减少或颜色改变等。如放线菌和霉菌在斜面上多次传代后产生“光秃”现象，从而造成生产上用孢子接种的困难。生产速度变慢。代谢产物的生产能力下降，即出现负突变。如黑曲霉的糖化力、放线菌抗生素的发酵单位的下降，所有这些都对生产不利。致病菌对宿主侵染能力的下降，如白僵菌对寄主致病能力的降低。对外界不良环境条件（抗噬菌体、抗低温和抗高温等）抵抗能力的下降等。,.,95,第五节菌种的保藏技术,2菌种退化的原因菌种退化的原因是多方面的，但是在生产实践中，必须将由于培养条件的改变导致菌种形态和生理上的变异与菌种退化区别开来。因为优良菌株的生产性能是和发酵工艺条件紧密相关的。如果培养条件发生变化，如培养基中缺乏某些元素，会导致产孢子数量减少，也会引起孢子颜色的改变；温度、pH的变化也会使发酵产量发生波动等。所有这些，只要条件恢复正常，菌种原有性状就能恢复正常，因此这些原因引起的菌种变化不能称为菌种退化。菌种退化的原因主要有以下几个方面：,.,96,第五节菌种的保藏技术,（1）基因突变菌种退化的主要原因是有关基因的负突变。当控制产量的基因发生负突变，就会引起产量下降；当控制孢子生成的基因发生负突变，则使菌种产孢子的性能下降等。一般而言，菌种的退化是一个从量变到质变的逐步演变过程。开始时，在群体中只有个别细胞发生负突变，这时如不及时发现并采用有效措施，就会造成群体中负突变个体的比例逐渐增高，最后发展成为优势群体，从而使整个群体表现出严重的退化现象。因此，突变在数量上的表现依赖于传代，即菌株处于一定条件下，群体多次繁殖，可使退化细胞在数量上逐渐占优势，于是退化性状的表现就更加明显，逐渐成为一株退化了的菌体。,.,97,第五节菌种的保藏技术,同时，对某一菌株的特定基因来讲，突变频率比较低，因此群体中个体发生生产性能的突变不是很容易的，但就一个经常处于旺盛生长状态的细胞而言，发生突变的机率比处于休眠状态的细胞大得多。因此，细胞的代谢水平与基因突变关系密切，应设法控制细胞保藏的环境，使细胞处于休眠状态，从而减少菌种的退化。,.,98,第五节菌种的保藏技术,（2）分离现象通过遗传育种获得的多核（或是单核）菌种，由于其