油镜使用及革兰氏染色

显微镜的使用,教学目标掌握油浸镜的使用原理,二染色原理和油镜的工作原理,1油镜工作原理油镜的放大倍数最大（100），故镜头焦距短，直径小,但所需光照强度却最大。从标本片透过的光线是从玻片进入空气，再进入镜头。由于玻璃和空气的介质密度不同，有些光会因折射或反射而不能进入镜头。物象就显现不清。为了不使通过的光线有所损失，须在油镜与玻片之间加入折射率和玻璃(n=1.52）相仿的香柏油(n=1.515)。故而称之为“油镜”。,转换器:其上装置各种不同放大倍数的物镜，用以转换物镜至使用位置上。,聚光镜:位于载物台的下方，可以上下移动，以使光线集中于检查的标本上光圈:位于聚光镜之下，可以放大和缩小；用以调节进入聚光镜的光量。,四、显微镜的使用1、取显微镜：右手握镜臂，左手托住镜座。2、打开电源（调节反光镜）使射入镜头光线最强。3、上提集光器。4、打开光圈。5、将标本片放在载物台上，用片夹固定。,6、调节转换器，先使低倍镜对准中央，寻找适宜的视野。7、于标本片的欲检部位滴加香柏油。8、然后转换油镜镜头，使其对准中央。9、两眼对准目镜，向上转动粗调节器，直至见到模糊物像为止。10、转动细调节器，直至物像完全清晰为止。,（）将载物台降至最低，取下标本片。（）将光量调至最小，关上电源。（）擦试镜头：先用干擦镜纸擦掉香柏油；再用滴加少量乙醚的擦镜纸擦试；最后再用干擦镜纸擦拭。（4）低倍镜对准中央（5）将显微镜放入镜箱，还原。,显微镜的维护,3-3,革兰氏染色法：革兰氏染色法将细菌分为G和G-，这由两类细菌细胞壁的结构和组成的不同而决定。用结晶紫初染后，所有的细菌都染上蓝紫色。碘作为媒染剂能与结晶紫结合形成结晶紫-碘的复合物，增强了染料与菌体的结合力。用乙醇脱色处理时，两类细菌的脱色效果是不同的。G细菌的细胞壁主要由肽聚糖形成的网状结构组成，且壁厚、类脂含量低，用乙醇脱色时使细胞壁脱水、网状结构孔径缩小，通透性降低，使得结晶紫碘的复合物不易被洗脱而保留在细胞内。虽经洗脱和复染仍然保持初染剂的蓝紫色。G-细菌则不同，由于其细胞壁肽聚糖层较薄，脂含量高，所以在脱色处理时，类脂被乙醇溶解，细胞壁的通透性增大，使结晶紫碘的复合物比较容易被洗脱出来，用复染剂复染后，细胞被染上复染剂的颜色。,3-4,实验器材1显微镜、香柏油、接种环、酒精灯等。2结晶紫染液（I）、碘液（II）、95%乙醇（III）、稀释的石碳酸复红染液（IV）。3菌种：大肠杆菌、金黄色葡萄球菌。,方法与步骤：,涂片干燥固定染色洗涤干燥镜检,3-5,实验步骤,1涂片取一块载玻片，用记号笔划分出两区域并做上记号，在两区域中央各滴半滴生理盐水，用接种环以无菌操作法分别取两种菌种在左右两滴盐水中，和匀后涂成薄膜。2干燥室温自然干燥或吹干。3固定涂面朝上，通过火焰23次。4染色在涂片薄膜上滴加结晶紫染液，使之覆盖2分钟。5水洗傾倒去染液，斜置载玻片，用洗瓶小水流沿玻片边缘冲洗，直至水呈无色为止。,3-6,6.媒染加媒染剂碘液使之覆盖1分钟，水洗。7.脱色滴加95%乙醇数滴，立即水洗,。8.复染复红液复染30s-1分钟，水洗，吸干。,注意事项：,（1）涂片不宜过厚，否则难以干燥。（2）涂片时滴加无菌水不宜多，否则难以干燥。（3）固定时，通过火焰速度宜适度，过快达不到固定目的，过慢易使菌体变形，绝不能在火焰上烤，招致原形毁坏。（4）标本必须干燥，才能置于油镜下观察。,3-7,实验结果观察两种细菌的形态和颜色，绘出油镜下细菌形态图，说明革兰氏染色的结果。思考题,1.通过实验，你认为革兰氏染色成功关键是那一步？为了避免假阳性或假阴性出现，