2019_2020学年高中生物专题5DNA和蛋白质技术课题2多聚酶链式反应扩增DNA片段课件新人教版选修1.pptx

课题2多聚酶链式反应扩增DNA片段,1PCR原理：(1)概念：PCR，即_反应，能以_为模板，在几小时内复制出上百万份的DNA拷贝，是一种体外迅速_的技术。,一、PCR原理与反应过程,基础梳理,多聚酶链式,极少量的DNA,扩增DNA片段,半保留,80100,复性,(3)条件。模板：_。引物：分别与两条模板链相结合的_。原料：四种_。酶：_的DNA聚合酶，一般选用_。其他条件：需要稳定的pH和能严格控制温度的温控设备。,DNA的两条单链,两种引物,脱氧核苷酸,耐热,Taq_DNA聚合酶,2PCR的反应过程：(1)循环次数：一般是_次。(2)过程。变性：当温度上升到_时，双链DNA_。复性：温度下降到_，两种引物通过_与两条单链DNA结合。,三十多,90以上,解聚为单链,50左右,碱基互补配对,延伸：温度上升到_，溶液中的四种脱氧核苷酸在_的作用下，根据_原则合成新的DNA链。(3)结果：DNA聚合酶只能特异地复制处于_之间的DNA序列，使这段固定长度的序列呈_扩增。,72左右,DNA聚合酶,碱基互补配对,两个引物,指数,1实验步骤：准备：按照PCR反应体系的配方将所需试剂摆放于实验桌上移液：用_按照配方在微量离心管中依次加入各组分,二、PCR的实验操作,微量移液器,混合：盖严离心管口的盖子，用手指轻轻弹击管的侧壁，使反应液_离心：将微量离心管放在离心机上，离心约10s。目的是使反应液集中在_反应：将离心管放入_中，设置程序进行反应,混合均匀,离心管底部,PCR仪,2操作提示：(1)为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的一些用具及缓冲液、蒸馏水等在使用前必须进行_。(2)PCR所用的缓冲液和酶应_，并在_下储存。,高压灭菌,分装成小份,20,(3)在微量离心管中添加反应成分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都_。所有的成分都加入后，盖严离心管口的盖子，用手指轻轻弹击管的侧壁，使反应液_。,必须更换,混合均匀,3实验中DNA含量的测定：(1)原理：DNA在_的紫外线波段有一强烈的吸收峰。峰值的大小与_的含量有关。可以利用DNA这一特点进行DNA含量的测定。(2)过程。稀释：取2LPCR反应液，加入98L蒸馏水，即将样品进行50倍稀释。,260nm,DNA,对照调零：以_作为空白对照，在波长_nm处，将紫外分光光度计的读数调节至零。测定：取DNA稀释液100L至比色杯中，测定_nm处的光吸收值。计算：DNA含量(g/mL)_。,蒸馏水,260,260,50(260_nm的读数)稀释倍数,1DNA聚合酶能延伸子链的3端或5端。解析DNA聚合酶只能延伸子链的3端。答案,即时反馈,2PCR反应始终在高于70的条件下进行。解析PCR反应中要调控不同温度，不能始终在同一温度下进行。答案,3PCR扩增与体内DNA复制不同，前者通过高温解开双链，后者通过解旋酶解开双链。答案,4PCR反应需要在一定的缓冲溶液中进行。答案,1PCR原理：(1)PCR反应与体内DNA复制的引物在化学本质上是否相同？请分析原因。,知识点一PCR原理与反应过程,互动探究,提示：不相同。体内DNA复制所需引物为RNA聚合酶合成的一小段RNA，但PCR反应时所用引物是人工加入的一小段DNA。,(2)判断PCR是否需要以下两种酶，说明判断的理由。解旋酶判断：_(填“是”或“否”)。理由：_。,否,PCR中解旋是通过控制温度实现的，在80100的温度内，DNA的双螺旋结构被打开,DNA聚合酶判断：_(填“是”或“否”)。理由：_。,是,DNA聚合酶能将单个核苷酸加到已有的单链片段的3端上，但该酶需耐高温,2PCR反应过程：(1)PCR的每次循环中应如何控制温度？请分析原因。提示：每次循环中先高温解旋，再低温使引物与模板结合，最后适当升温有利于TaqDNA聚合酶发挥作用。,(2)结合下图分析PCR过程中DNA链复制的方向是怎样的。,提示：DNA聚合酶能从引物的3端开始延伸DNA链DNA链复制的方向总是从子链的5端向3端延伸。,PCR扩增与DNA复制的异同,核心归纳,1PCR是一种体外迅速扩增DNA片段的技术，下列有关PCR过程的叙述，不正确的是,对点训练,A变性过程中破坏的是DNA分子内碱基对之间的氢键B复性过程中引物与DNA模板链的结合依靠碱基互补配对原则完成C延伸过程中需要DNA聚合酶、ATP、四种核糖核苷酸DPCR与细胞内DNA复制相比所需要酶的最适温度较高,解析变性过程是打开DNA双链之间的氢键，A正确。复性过程是引物与DNA模板根据碱基互补配对而形成氢键，B正确。延伸过程需要的是Taq酶，ATP和四种脱氧核糖核苷酸，C错误。PCR与细胞内DNA复制相比需要的酶的温度高，D正确。答案C,2有关PCR技术的说法，错误的是A是一项在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术BPCR技术的原理是DNA双链复制C操作过程要有一段已知目的基因的核苷酸序列DPCR扩增中必须有解旋酶才能解开双链DNA,解析PCR技术是一项在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术，A正确；PCR技术的原理是DNA双链复制，B正确；PCR技术的前提是要有一段已知的目的基因的核苷酸序列，以便根据该核苷酸序列合成引物，C正确；双链DNA模板在热作用下，氢键断裂，形成单链DNA，可见该过程不需要解旋酶解开双链DNA，D错误。答案D,1实验过程分析：(1)分析离心的目的，说出离心管盖子盖严的原因。离心的目的是_。,知识点二PCR的实验操作,互动探究,使反应液集中在离心管底部，提高反应效率,离心管的盖子一定要盖严，原因是_。(2)离心前用手轻轻弹击离心管侧壁的目的是_。,防止实验中脱落或液体外溢,使反应液混合均匀,(3)PCR实验中使用的微量离心管、枪头、缓冲液以及蒸馏水等在使用前必须进行高压蒸汽灭菌，为什么这样操作？还有哪项操作与此目的相同？提示：为避免外源DNA等的污染。在微量离心管中添加反应成分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换。,2结果检测：(l)实验中为什么要测定DNA的含量？提示：实际操作过程中会有许多因素影响DNA含量，所以需要对DNA含量进行测定。,(2)如何判断DNA扩增成功？提示：可以通过计算DNA含量来评价扩增的效果。电泳检测的方法，可以通过在紫外线下直接观察DNA带的分布及粗细程度来评价扩增的效果。,PCR扩增的注意事项(1)DNA复制需要引物的原因：DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，而只能从3端延伸DNA链。PCR中，引物长度通常为2030个核苷酸。,核心归纳,(2)当DNA变性后PCR反应体系的温度快速冷却到50左右时，引物与模板可结合，一般不需要考虑解开的两个DNA模板链的重新结合，原因是：模板DNA链比引物长得多而且复杂得多，不易重新结合。引物和模板之间的碰撞机会远远高于模板互补链之间的碰撞机会。加入的引物的量足够大，而模板链数量少。,3(2019德州检测)下列对PCR操作过程的叙述，错误的是,对点训练,APCR反应中使用的微量离心管、枪头、缓冲液以及蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌BPCR所用的缓冲液和酶应分装成小份，并在20储存CPCR所用的缓冲液和酶从冰箱拿出之后，迅速融化D在微量离心管中添加反应成分时，每吸取一种试剂后，移液器上的吸液枪头都必须更换,解析为了避免外源DNA等因素的污染，PCR反应中使用的微量离心管、枪头、缓冲液以及蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌；PCR所用的缓冲液及酶应分装成小份保存，并使用一次性吸液枪头。在冰箱中放置的缓冲液和酶取出后应放在冰块上缓慢融化，而不能迅速融化。答案C,4PCR利用了DNA的热变性原理，PCR仪实际上也是一种能自动调控温度的仪器。对PCR过程中“温度的控制”的说法，错误的是APCR反应需要高温，是为了确保模板是单链B延伸的温度必须大于复性温度而小于变性温度C