引物设计实例.ppt

引物设计实例分析,引物设计基本原则,引物长度（primerlength）产物长度（productlength）序列Tm值(meltingtemperature)G+C含量（composition）引物二聚体及发夹结构（duplexformationandhairpin）阅读框,1.引物的长度,一般为15-30bp，常用的是18-27bp，但不能大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74，即Taq酶的最适温度,2.产物的长度,扩增片段长度为100600碱基对.,3.Tm值,引物的Tm值一般控制在55-60度,尽可能保证上下游引物的Tm值一致,一般不超过2度.如果引物中的G+C含量相对偏低,则可以使引物长度稍长,而保证一定的退火温度.Tm=2(A+T)+4(C+G),4.引物的GC含量,有效引物中(G+C)的比例为40-60%，过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大。,5.引物自身,引物间3端的互补、二聚体或发夹结构也可能导致PCR反应失败,任务用绿色荧光蛋白(GFP)标记蛋白NR1,SP,BamHI,pcDNA3.1,NR1,Plasmid1:,Plasmid2,GFP,SP,BamHI(GGATCC),pcDNA3.1,NR1-1a,GFP,121ggggctcctagagaacccgggggcgcttgaccgcgcgcgggcggcccgcgggtcgtacat181cgcgaggtcgtcgcactcgcgcaacccagagccaggcccgctgtgcccggagctcatgag241caccatgcacctgctgacattcgccctgcttttttcctgctccttcgcccgcgcggatcc301cgaccccaagatcgtcaacatcggcgcggtgctgagcacgcgcaagcatgaacagatgtt361ccgcgaggcagtaaaccaggccaataagcgacacggctcttggaagatacagctcaacgc421cacttctgtcacccacaagcccaacgccatacagatggccctgtcagtgtgtgaggacct481catctctagccaggtctacgctatcctagttagccacccgcctactcccaacgaccactt541cactcccacccctgtctcctacacagctggcttctacagaatccctgtcctgggactgac601tacccgaatgtccatctactctgacaagagtatccacctgagtttccttcgcacggtgcc661gccctactcccaccagtccagcgtctggtttgagatgatgcgagtctacaactggaacca721catcatcctgctggtcagcgacgaccacgagggacgggcagcgcagaagcgcttggagac781gttgctggaggaacgggagtccaaggcagagaaggtgctgcagtttgacccaggaaccaa,NR1的编码序列(4000bp),红色为信号肽,蓝色为BamHI酶切位点,下划线标出酶切位点的阅读框,ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCTTCGGCTACGGCCTGCAGTGCTTCGCCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCTACCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAA,GFP序列(700bp),引物要求,PCR扩增GFPGFP两边添加BamHI酶切位点保证NR1的阅读框不改变,5ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAA33TACCACTCGTTCCCGCTCCTCGAGAGCCGTACCTGCTCGACATGTTCATT5,GFP序列,5ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAA3,3TACCACTCGTTCCCGCTCCTCGCGTACCTGCTCGACATGTTCATT5,Primer1:5ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGC,.AGAGCCGTACCTGCTCGACATGTTCATT5Primer2,Primer1:5ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGC.,Primer2:5TTACTTGTACAGCTCGTCCATGCCGAGA.,Primer1:5ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGC.,Primer2:5CTTGTACAGCTCGTCCATGCCGAGA.,第一步：扩增GFP基本序列,变性,引物复性,第二步：GC比值；Tm值,Primer1:5ATGGTGAGCAAGGGCGAGGA.Primer2:5CTTGTACAGCTCGTCCATGCCGAGA.,Primer1:5ATGGTGAGCAAGGGCGAGGA（GC:60%,Tm：64）Primer2:5CTTGTACAGCTCGTCCATGCC（GC:57%,Tm：66）,第三步：酶切位点,Primer1:5ATGGTGAGCAAGGGCGAGGA（GC:60%,Tm：64）Primer2:5CTTGTACAGCTCGTCCATGCC（GC:57%,Tm：66）,BamHI:ggatcc,Primer1:5ggatccATGGTGAGCAAGGGCGAGGAPrimer2:5ggatccCTTGTACAGCTCGTCCATGCC,第四步：阅读框,atgagcaccatgcacctgctgacattcgccctgcttttttcctgctccttcgcccgcgcggatcccgaccccaagatcgtcaacatcggcgcggtgctgagcacgcgcaagcatgaacagatgttccgcgaggcagtaaaccaggccaataagcgacacggctcttggaagatacagctcaacgccacttctgtcacccacaagcccaacgccatacagatggccctgtcagtgtgtgaggacct.,Primer1:5ggatccATGGTGAGCAAGGGCGAGGA,NR1序列：,Primer1:5ggatccTATGGTGAGCAAGGGCGAGGA,atgagcaccatgcacctgctgacattcgccctgcttttttcctgctccttcgcccgcgcggatcccgaccccaagatcgtcaacatcggcgcggtgctgagcacgcgcaagcatgaacagatgttccgcgaggcagtaaaccaggccaataagcgacacggctcttggaagatacagctcaacgccacttctgtcacccacaagcccaacgccatacagatggccctgtcagtgtgtgaggacct,NR1序列：,5ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAA3,GFP序列,cgcgcggatccTATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAG?ggatcccgaccccaagatcgtcaacatcggcgcggtgctgagcacgcgcaagcatgaacagatgttccgcgaggcagtaaaccaggccaataagcgacacggctcttggaagatacagctcaacgccacttctgtcacccacaagcccaacgccatacagatggccctgtcagtgtgtgagg