PCR技术7ppt课件

PCR技术,1,第一节PCR技术的基本原理第二节PCR反应体系中的各种组分分析第三节PCR技术的分类第四节PCR技术的应用第五节DNA分子标记,内容,2,基因克隆,目的基因的分离和制备,目的基因的体外重组,重组子导入宿主细胞,3,4,PCR,Polymerasechainreaction，聚合酶链式反应PCR的最早设想：1971年，Korana最早提出核酸体外扩增的设想：“经过DNA变性，与合适的引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可克隆tRNA基因”。PCR的实现：1983年，美国PE-Cetus公司人类遗传研究室的科学家K.B.Mullis等人发明了PCR，又称为基因的体外扩增法。1985年公开报道,5,PCR,1987年PCR得到美国的专利权1989年PCR技术被“Science”杂志评为十大科技新闻之一1993年Mullis因发明了PCR而获得诺贝尔化学奖,6,PCR技术操作简便，可以在试管中建立反应，经数小时之后，就能将极微量的目的基因或某一特定的DNA片段扩增109倍，且无需烦琐的基因克隆程序，便可获得足够数量的精确的DNA拷贝。,7,第一节PCR技术的基本原理,一、PCR技术的基本原理二、PCR扩增过程三、PCR技术的特点,8,一、PCR技术的基本原理,依据体内DNA的半保留复制机理及DNA分子在不同温度下双链和单链可以相互转变的性质，人为地控制体外合成系统的温度，使双链DNA变成两条单链DNA，单链DNA用4种dNTPs在引物和DNApol的作用下合成新生的DNA互补链。,9,二、PCR扩增过程,变性（denaturation）,退火（annealing）,延伸（extension）,10,1、高温变性,在高温条件下，使DNA双螺旋的氢键断裂，双链DNA变成单链DNA变性温度：9497，常953050s，常30s,变性,引物,11,2、低温退火,当温度降低时，由于模板分子的结构较引物复杂，且反应体系中引物的量大大多于模板DNA，使引物于其互补的模板在局部形成杂交链。退火温度：2560，常556090s，常60s,12,3、适温延伸,在DNApol和4种dNTPs底物及Mg2+存在的条件下，pol催化以引物位起点的DNA链的延伸反应延伸温度：7074，常7260120s,13,PCR原理,14,PCR扩增过程,PCR扩增过程,15,PCR原理,16,PCR的反应动力学,理论上为2n。30次循环，DNA产量达109拷贝实际上为(1+R)n。R为扩增效率，平均为75%30次循环，DNA产量实际为106-107拷贝,17,三、PCR技术的特点,高度的敏感性高度的特异性操作简便、快速适用样品的广泛性,18,高度的敏感性,可将极微量（pg级）DNA扩增到紫外光下可见的水平（g级）从100万个细胞中检出一个靶细胞；在细菌学中最小检出率为3个细菌对单拷贝基因、单根头发、一滴血等微量标本进行分析,19,高度的特异性,PCR反应的特异性决定因素为：引物与模板DNA特异正确的结合；碱基配对原则；TaqDNA聚合酶合成反应的忠实性；靶基因的特异性与保守性。,20,高度的特异性,PCR扩增的特异性依赖于两个引物的好坏，依赖于引物与模板结合的正确性只要引物设计合理、反应温度适宜，PCR的特异性是相当高的,21,操作简便快速,PCR仪1-2小时或数小时扩增产物一般用电泳分析，不一定要用同位素，无放射性污染、易推广,22,PCR仪生产厂家,中国科学院遗传研究所复旦大学北京市应用新技术研究所美国PerkinElmer公司的TC1、480、9600瑞典Pharmacia公司的GeneATAGTMPCR,23,PCR仪种类,机械手臂式（转移式）PCR变温式（固定式）PCR,24,PCR仪,25,techgene英PCR仪,SRX-481高效水冷全自动基因扩增仪,26,半导体式全自动PCR仪,27,适用样品的广泛性,对标本的纯度要求低：不需要分离病毒或细菌及培养细胞，DNA粗制品及总RNA均可作为扩增模板。可直接用临床标本如血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等粗制的DNA扩增检测。可以DNA或RNA，纯化的或粗制的；新鲜组织或陈旧样品；细胞或体液；完整大分子或部分降解的DNA,28,第二节PCR反应体系中的各组分分析,一、引物二、DNApol三、DNA模板四、dNTPs五、PCR反应的缓冲液六、Mg2+七、PCR反应条件的选择八、标准的PCR反应体系,29,一、引物,引物的设计决定PCR反应的成败PCR的效率和特异性取决于：1、引物与模板的特异结合2、聚合酶对引物的有效延伸,30,引物设计原则,1、引物长度以16-30为宜引物过短，特异性降低引物过长，成本增加，PCR的最适延伸温度会超过TaqDNApol的最适温度若引物长8bp，则平均每隔48=65536bp就有一个结合位点。人大约有43000个可能的结合位点若引物长16bp，则平均每隔416=4.29109bp有一个结合位点。,31,引物设计原则,2、引物扩增跨度：以200-500bp为宜，特定条件下可扩增长至10kb的片段3、引物碱基：G+C含量以40-60%为宜4、碱基分布的随机性：ATGC随机分布，避免5个以上的相同碱基成串排列。尤其是引物的3端，不应有连续3个G或C5、避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别是3端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带。,32,引物设计原则,6、两引物之间不互补，一对引物之间不应多于4个连续碱基有互补性，以免产生引物二聚体7、引物3端是引发延伸的点，不应错配：由于ATGC引起错配有一定规律，以引物3端T影响最大，因此，3端的末位碱基最好选ACG，而不选T。8、引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。同源性不要超过70%或有连续8个互补碱基同源,33,引物设计原则,9、引物5端可以修饰加酶切位点；用生物素、荧光物质、地高辛等标记；引入突变位点；引入启动子序列；引入蛋白质结合序列5端修饰后不影响正常的PCR反应,34,常用引物修饰法,返回,35,引物的保存和使用浓度,冻干，-20，可保存1年，常保存6月使用最终浓度：0.2-1.0mol/L，适宜小于0.2mol/L，影响产量大于1.0mol/L，不经济，出现非特异性扩增产物和引物二聚体,36,二、DNAPol,Mullis最初使用的DNA聚合酶是E.coliDNApolI的Klenow片段缺点：1、Klenow酶不耐高温，90会变性失活，每次循环都要重新加。2、引物链延伸反应在37下进行，容易发生模板和引物之间的碱基错配，其PCR产物特异性较差，合成的DNA片段不均一。,37,T4DNApol和T7DNApol,1988年初，Keohanog改用T4DNApol进行PCR，其扩增的DNA片段很均一，真实性也较高，只有所期望的一种DNA片段。但每循环一次，仍需加入新酶。T7DNApol,38,TaqDNApol的发现,1976年，Chein分离出一种热稳定的聚合酶1986年，Erlich从美国黄石国家森林公园火山温泉中分离并纯化了TaqDNApol，生长在70-75极富含矿物质的环境中1988年，R.K.Saiki等成功将TaqDNApol应用于PCR。,39,用于PCR的pol种类,水生栖热菌(Thermusaquaticus)yT1株分离提取的TaqDNApol。嗜热栖热菌（Thermusthermophilus）提取的TthDNApol，活性是TaqDNApol的100倍栖热球菌（Thermococcuslitoralis）中分离的VENT酶，100时半衰期达95min酸热浴硫化裂片菌中分离的Sac酶，耐受100,40,各种耐热DNApol的特性,41,TaqDNApol的特点,耐高温。在70下反应2h后其残留活性是原来的90%，在93下反应2h后其残留活性是原来的60%，在95下反应2h后其残留活性是原来的40%。在热变性时不会被钝化，不必在每次扩增反应后再加新酶大大提高了扩增片段特异性和扩增效率，增加了扩增长度(2.0Kb),42,TaqDNApol酶活性,75-80，150bp/s72，100bp/s70，60bp/s55，22bp/s37，1.5bp/S22，0.25bp/s,43,离子依赖性,TaqDNA聚合酶是Mg2+依赖性酶，该酶的催化活性对Mg2+浓度非常敏感Mg2+浓度过低，Taq酶活力下降；Mg2+浓度过高，使酶催化非特异性扩增,44,TaqDNApol的忠实性,TaqDNApol具有53聚合酶活性和53外切酶活性，而无35外切活性，因而无效正阅读功能，在扩增中可引起错配。TaqDNA聚合酶的碱基错配机率为2.110-4.降低Mg2+浓度（1.5mmol/L），降低dNTPs浓度（20mol/L），提高退火温度（大于55），缩短延伸时间（60s）可提高TaqDNApol的忠实性，此时的平均错配率为510-6.,45,TaqDNApol的抑制剂,低浓度的尿素、甲酰胺、二甲基甲酰胺(DMF)和二甲基亚砜(DMSD)对TaqDNApol的催化活性并无影响.极低浓度的离子表面活性剂如脱氧胆胺酸钠(小于0.06%)，十二烷基肌氨酸钠(小于0.02%)，SDS(小于0.01%)几乎可完全抑制该酶的活性.非离子表面活性剂在较高浓度(Tween20，NP-40和Tritox-100)如5%时方能抑制该酶的活性.,46,TaqDNApol的灭活,100加热10min以上加入10mmol/LEDTA，使其结合Mg2+,47,TaqDNApol的使用浓度和生产厂家,每100l反应液中含2.5lTaqDNApol为宜TaqDNApol应于-20保存复旦大学、中科院遗传所、军事医学科学院、上海华美公司不同厂家酶的定位及生产条件不同，可根据具体情况区别使用,48,三、DNA模板,模板的来源培养细胞、细菌、病毒、组织、病理标本、考古标本、血液、毛发、尿液、犯罪现场DNA或RNA，RNA作模板时要反转录成cDNA,49,DNA模板的用量,理论上102-104拷贝的模板可满足各种要求的PCR反应E.coliDNA0.1ng3104拷贝人染色体DNA0.1g3104拷贝酵母DNA1ng3104拷贝,50,DNA模板的纯度,DNA样品尽量要纯，尤其不能有核酸酶及蛋白酶等大多PCR，对DNA模板的要求不严格，存在一定量的蛋白质、SDS等对实验影响不大没有交叉污染,51,DNA模板的制备,传统的核酸模板提取方法是采用去垢剂如SDS等来破坏细胞组份，溶解细胞膜，使蛋白质变性，再用蛋白酶K来消化去除蛋白质，尤其是与DNA结合的蛋白质，再用酚:氯仿抽提，然后用乙醇或异丙醇沉淀核酸，供PCR实验用,52,DNA模板的制备,SDS溶解细胞膜上的脂类与Pr，溶解膜蛋白而破坏细胞膜，并解离细胞中的核蛋白，SDS与Pr结合而沉淀；蛋白酶K水解消化Pr，特别是与DNA结合的组蛋白，再用酚与氯仿抽提Pr和其它细胞组份，用乙醇或异丙醇沉淀核酸。提取的核酸即可作为模板用于PCR反应。一般临床检测标本，可采用快速简便的方法溶解细胞，裂解病原体，消化除去染色体的Pr使靶基因游离，直接用于PCR扩增。RNA模板提取一般采用异硫氰酸胍或蛋白酶K法，要防止RNase降解RNA。,53,四、dNTPS,dATP、dTTP、dGTP、dCTP.dNTP粉呈颗粒状，如保存不当易变性失去生物学活性dNTP溶液呈酸性，使用时应用1MNaOH将其PH调节到7.07.5，小量分装，-20冰冻保存。多次冻融会使dNTP降解,54,dNTP的浓度,PCR常用的dNTP浓度为50200umol/L4种dNTP的浓度要相等(等摩尔配制)如其中任何一种浓度不同于其它几种时(偏高或偏低)，就会引起错配。dNTP浓度过低会使反应速度下降，降低PCR产物的产量，但可提高实验的精确性。dNTP浓度过高，可加快反应速度，但也增加碱基的错配率和实验成本dNTP能与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度降低。,55,五、PCR反应的缓冲液,PCR中常使用10-50mmol/LTris-HCl（pH8.3-8.8）缓冲液作用：调节pH值，使TaqDNApol作用环境维持偏碱性,56,缓冲液配方,10-50mmol/LTris-HCl，50mmol/LKCl，有利于引物退火，大于此浓度会抑制TaqDNApol的活性100g/LBSA（小牛血清），保护酶0.05-0.1%Tween-20，保护酶5mmol/LDTT（二硫苏糖醇），保护酶10%DMSO（二甲基亚砜），减少模板二级结构，提高反应特异性5%甲酰胺或5%氯化四甲基胺（TMAC），提高反应特异性，对酶活性无明显影响,57,六、Mg2+浓度,PCR反应体系中，dNTPs、引物、DNA模板等中的磷酸基团均可与Mg2+结合而降低Mg2+浓度Mg2+浓度要比dNTP的浓度高0.2-2.5mmol/L在一般的PCR反应中，各种dNTP浓度为200umol/L时，Mg2+浓度为1.52.0mmol/L为宜。,58,七、PCR反应条件的选择,变性温度和时间退火温度和时间延伸温度和时间循环次数,59,变性温度与时间,DNA中GC含量越高，要求的变性温度越高通常为9530s，或9394lmin第一次反应时反应管达到所需温度需要一段时间，因此要适当延长时间。最好为95，4-6min，在以后的循环中，变性步骤设为9530s为防止在变性温度时反应液的蒸发，可在反应管中加入液体石蜡,60,退火温度与时间,退火温度与时间，取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有靶基序列的长度。对于20个bp，G+C含量约50%的引物，55为最适退火温度较为理想。公式帮助选择合适的温度：Tm=4(G+C)2(A+T)复性温度=Tm(510)在Tm值允许范围内，选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合，提高PCR反应的特异性。复性时间一般为3060sec，足以使引物与模板之间完全结合。,61,延伸温度与时间,PCR反应的延伸温度一般选择在7075之间，常用温度为72，过高的延伸温度不利于引物和模板的结合PCR延伸反应的时间，可根据待扩增片段的长度而定，一般1Kb以内的DNA片段，延伸时间1min是足够的。34kb的靶序列需34min；扩增10Kb需延伸至15min。延伸进间过长会导致非特异性扩增带的出现。对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些,62,延伸终止,最后一个反应循环结束后，应使PCR反应在72进一步延伸5min，以提高产物的扩增率，然后将反应混合液冷却至4，或加入EDTA到10mmol/L终止反应,63,循环次数,循环次数决定PCR扩增程度。PCR循环次数主要取决于模板DNA的浓度。一般的循环次数选在3040次之间，循环次数越多，非特异性产物的量亦随之增多。,64,八、标准的PCR反应体系,10扩增缓冲液10ul4种dNTP混合物各200umol/L2个引物各10100pmol模板DNA0.12ugTaqDNA聚合酶2.5uMg2+1.5mmol/L加双或三蒸水至100ul,65,九、PCR扩增产物的分析,凝胶电泳分析酶切分析分子杂交核酸序列分析,66,凝胶电泳分析,PCR产物电泳，EB染色紫外分析仪下观察，初步判断产物的特异性。PCR产物片段的大小应与预计的一致，特别是多重PCR，应用多对引物，其产物片断都应符合预计的大小，这是起码条件。琼脂糖凝胶电泳：通常用12%的琼脂糖凝胶聚丙烯酰胺凝胶电泳：610%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离效果比琼脂糖好，条带比较集中，可用于科研及检测分析,67,凝胶电泳分析,68,PCR扩增P53基因,69,酶切分析,根据PCR产物中限制性内切酶的位点，用相应的酶切、电泳分离后，获得符合理论的片段，此法既能进行产物的鉴定，又能对靶基因分型，还能进行变异性研究。,70,PCR产物的酶切,71,分子杂交,分子杂交是检测PCR产物特异性的有力证据，也是检测PCR产物碱基突变的有效方法。Southernblotting：在两引物之间另合成一条寡核苷酸链标记后做探针，与PCR产物杂交。此法既可作特异性鉴定，又可以提高检测PCR产物的灵敏度，还可知其分子量及条带形状，主要用于科研。斑点杂交：将PCR产物点在NC膜或尼膜膜上，再与内部寡核苷酸探针杂交，观察有无着色斑点，主要用于PCR产物特异性鉴定及变异分析。,72,核酸序列分析,是检测PCR产物特异性的最可靠方法。,73,十、常见问题分析与对策,假阴性，不出现扩增条带假阳性出现非特异性扩增带出现片状拖带或涂抹带PCR污染与对策,74,假阴性，不出现扩增条带,PCR反应的关键环节：模板核酸的制备引物的质量与特异性酶的质量PCR循环条件,75,假阴性的原因模板,模板中含有杂蛋白质模板中含有Taq酶抑制剂模板中蛋白质没有消化除净，特别是染色体中的组蛋白在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚模板核酸变性不彻底,76,假阴性的原因酶失活,酶失活：需更换新酶，或新旧两种酶同时使用，以分析是否因酶的活性丧失或不够而导致假阴性。需注意的是有时忘加Taq酶或溴乙锭,77,假阴性的原因引物,引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称，是PCR失败或扩增条带不理想、容易弥散的常见原因。选定一个好的引物合成单位引物的浓度不仅要看OD值，更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳，一定要有引物条带出现，而且两引物带的亮度应大体一致引物应高浓度小量分装保存，防止多次冻融或长期放冰箱冷藏，导致引物变质降解失效引物设计不合理，如引物长度不够，引物之间形成二聚体等。,78,假阴性的原因Mg2+浓度,Mg2+浓度对PCR扩增效率影响很大浓度过高可降低PCR扩增的特异性浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带。,79,假阴性的原因反应体积的改变,通常进行PCR扩增采用的体积为20ul、30ul、50ul或100ul，应用多大体积进行PCR扩增，是根据科研和临床检测不同目的而设定，在做小体积如20ul后，再做大体积时，一定要模索条件，否则容易失败。,80,假阴性的原因物理原因,变性温度低，变性时间短，极有可能出现假阴性退火温度过低，可致非特异性扩增而降低特异性扩增效率退火温度过高影响引物与模板的结合而降低PCR扩增效率用标准的温度计检测一下扩增仪或水溶锅内的变性、退火和延伸温度，这也是PCR失败的原因之一,81,假阴性的原因靶序列变异,靶序列发生突变或缺失，影响引物与模板特异性结合靶序列某段缺失使引物与模板失去互补序列，其PCR扩增是不会成功的,82,假阳性,所有样品均为阳性引物设计不合适靶序列或扩增产物的交叉污染,83,假阳性的原因引物设计不合适,选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性，因而在进行PCR扩增时，扩增出的PCR产物为非目的性的序列靶序列太短或引物太短，容易出现假阳性需重新设计引物,84,假阳性的原因靶序列或扩增产物的交叉污染,1、整个基因组或大片段的交叉污染，导致假阳性。这种假阳性可用以下方法解决：操作时应小心轻放，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。所用离心管及样进枪头等均应一次性使用必要时，在加标本前，反应管和试剂用紫外线照射，以破坏存在的核酸。,85,假阳性的原因靶序列或扩增产物的交叉污染,2、空气中的小片段核酸污染，这些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。与引物互补后，可扩增出PCR产物，而导致假阳性的产生,86,出现非特异性扩增带,PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带,87,出现非特异性扩增带的原因,引物与靶序列不完全互补、或引物聚合形成二聚体Mg2+离子浓度过高、退火温度过低，及PCR循环次数过多有关酶的质和量，往往一些来源的酶易出现非特异条带而另一来源的酶则不出现，酶量过多有时也会出现非特异性扩增。,88,出现非特异性扩增带采取的对策,必要时重新设计引物减低酶量或调换另一来源的酶降低引物量，适当增加模板量，减少循环次数适当提高退火温度或采用二温度点法(93变性，65左右退火与延伸)。,89,出现片状拖带或涂抹带,PCR扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带,90,出现片状拖带的原因,酶量过多或酶的质量差dNTP浓度过高Mg2+浓度过高退火温度过低循环次数过多,91,出现片状拖带的对策,减少酶量，或调换另一来源的酶减少dNTP的浓度适当降低Mg2+浓度增加模板量减少循环次数。,92,污染原因,1、标本间交叉污染标本污染主要有收集标本的容器被污染标本放置时，由于密封不严溢于容器外容器外粘有标本而造成相互间交叉污染标本核酸模板在提取过程中，由于吸样枪污染导致标本间污染有些微生物标本尤其是病毒可随气体扩散，导致彼此间的污染.,93,污染原因,2、PCR试剂的污染主要是由于在PCR试剂配制过程中，由于加样枪、容器、双蒸水及其它溶液被PCR核酸模板污染.,94,污染原因,3、PCR扩增产物污染，这是PCR反应中最主要最常见的污染问题因为PCR产物拷贝量大(一般为1013拷贝/ml)，远远高于PCR检测数个拷贝的极限，所以极微量的PCR产物污染，就可形成假阳性还有一种容易忽视，最可能造成PCR产物污染的形式是气溶胶污染；在空气与液体面摩擦时就可形成气溶胶，在操作时比较剧烈地摇动反应管，开盖时、吸样时及污染进样枪的反复吸样都可形成气溶胶而污染。据计算一个气溶胶颗粒可含48000拷贝，因而由其造成的污染是一个值得特别重视的问题,95,污染原因,4、实验室中克隆质粒的污染在分子生物学实验室及某些用克隆质粒做阳性对照的检验室，这个问题也比较常见。因为克隆质粒在单位容积内含量相当高，另外在纯化过程中需用较多的用具及试剂，而且在活细胞内的质粒，由于活细胞的生长繁殖的简便性及具有很强的生命力，其污染可能性也很大,96,污染的监测,一个好的实验室，要时刻注意污染的监测，考虑有无污染是什么原因造成的污染，以便采取措施，防止和消除污染.阳性对照阴性对照重复性试验选择不同区域的引物进行PCR扩增,97,阳性对照,在建立PCR反应实验室及一般的检验单位都应设有PCR阳性对照，它是PCR反应是否成功、产物条带位置及大小是否合乎理论要求的一个重要的参考标志。阳性对照要选择扩增度中等，重复性好，经各种鉴定是该产物的标本如以重组质粒为阳性对照，其含量宜低不宜高(100个拷贝以下)。但阳性对照尤其是重组质粒及高浓度阳性标本，其对检测或扩增样品污染的可能性很大。因而当某一PCR试剂经自己使用稳定，检验人员心中有数时，在以后的实验中可免设阳性对照.,98,阴性对照,每次PCR实验务必做阴性对照标本对照:被检的标本是血清就用鉴定后的正常血清作对照;被检的标本是组织细胞就用相应的组织细胞作对照.试剂对照:在PCR试剂中不加模板DNA或RNA，进行PCR扩增，以监测试剂是否污染.,99,防止污染的方法,合理分隔实验室:将样品的处理、配制、PCR反应液、PCR循环扩增及PCR产物的鉴定等步骤分区或分室进行，特别注意样本处理及PCR产物的鉴定应与其它步骤严格分开.最好能划分标本处理区；PCR反应液制备区；PCR循环扩增区；PCR产物鉴定区。实验用品及吸样枪应专用实验前应将实验室用紫外线消毒以破坏残留的DNA或RNA,100,防止污染的方法,吸样枪：吸样枪污染是一个值得注意的问题。由于操作时不慎将样品或模板核酸吸入枪内或粘上枪头是一个严重的污染源，因而加样或吸取模板核酸时要十分小心，吸样要慢，吸样时尽量一次性完成，忌多次抽吸，以免交叉污染或产生气溶胶污染,101,防止污染的方法,预混和分装PCR试剂：所有的PCR试剂都应小量分装，如有可能，PCR反应液应预先配制好，然后小量分装，-20保存.以减少重复加样次数，避免污染机会.PCR试剂，PCR反应液应与样品及PCR产物分开保存，不应放于同一冰盒或同一冰箱,102,防止污染的方法,防止操作人员污染，使用一次性手套、吸头、小离心管应一次性使用.设立适当的阳性对照和阴性对照，阳性对照以能出现扩增条带的最低量的标准病原体核酸为宜，并注意交叉污染的可能性，每次反应都应有一管不加模板的试剂对照及相应不含有被扩增核酸的样品作阴性对照,103,防止污染的方法,减少PCR循环次数，只要PCR产物达到检测水平就适可而止.选择质量好的Eppendorf管，以避免样本外溢及外来核酸的进入，打开离心管前应先离心，将管壁及管盖上的液体甩至管底部。开管动作要轻，以防管内液体溅出.,104,第三节PCR技术的分类,正常PCR,巢式PCR,复合PCR,不对称PCR,反转录PCR,反向PCR,锚定PCR,原位PCR,免疫PCR,彩色PCR,修饰引物PCR,固着PCR,膜结合PCR,重组PCR,105,正常PCR（NormalPCR）,一般的DNA模板采用一对引物，经30轮左右循环扩增，即可达到预期的目的常用于多拷贝DNA分子的扩增PCR产物的检测：琼脂糖凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳,返回,106,巢式PCR（NestedPCR）,先用一对引物对模板进行扩增，取出第一次PCR产物，然后再用另一对引物扩增第一次PCR产物,107,第一次PCR,第二次PCR,外引物（outer-primer）,内引物（inter-primer）,108,分类,半巢式PCR中途进退式PCR,109,半巢式PCR,Semi-nestedPCR只有一个外引物对模板进行扩增，取出第一次PCR产物，然后用另一对内引物扩增PCR产物,110,中途进退式PCR,Drop-inDrop-outPCR外引物设计得比内引物长一些，且用量较少，同时在第一次PCR时采用较高的退火温度，而第二次PCR采用较低的退火温度，这样在第一次PCR时，由于较高的退火温度内引物不能与模板结合，故只有外引物扩增产物。经过若干循环,待外引物基本消耗完毕后,无须取出第一次PCR产物,只需降低退火温度,即可直接进行第二次PCR扩增.,111,巢式PCR的应用,用于极少量模板的扩增,112,复合PCR,MultiplexPCR，多重引物PCR，多重PCR在同一PCR反应中，用多组引物同时扩增几个基因片段的技术,113,114,复合PCR产物的电泳图谱,1,2,3,4,marker,115,复合PCR的应用,1、多种病原微生物的同时检测或鉴定肝炎病毒的感染：甲乙丙型肝炎病毒肠道致病性细菌的检测：伤寒，痢疾和霍乱性病的检测，如梅毒，淋病及艾滋病的诊断.战伤细菌及生物战剂细菌的检测，如破伤风杆菌，产气荚膜杆菌，炭疽杆菌，鼠疫杆菌等侦检需特殊培养的无芽胞厌氧菌，如脆弱类杆菌、艰难杆菌的鉴定等.,116,复合PCR的应用,2、病原微生物，某些遗传病及癌基因的分型鉴定乙型肝炎病毒的分型乳头瘤病毒的分型单纯疱疹病毒的分型杜氏肌营养不良症的分型癌基因的检测等,117,复合PCR的应用,3、多点突变性分子病的诊断与疾病相关的基因十分庞大，如Rb（视网膜母细胞瘤）基因有数百个kb，而DMD（进行性肌营养不良症）有2000kb。基因上有多处位点发生缺失或突变。采用复合PCR可在同一试管中加入多对引物，扩增同一模板的几个区域，如果基因的某一区段缺失，则相应的电泳图谱上这一区带就会消失,118,多重PCR的特点,高效性，在同一PCR反应管内同时检出多种病原微生物，或对有多个型别的目的基因进行分型，特别是用一滴血就可检测多种病原体系统性，多重PCR很适宜于成组病原体的检测，如肝炎病毒，肠道致病性细菌，性病，无芽胞厌氧菌，战伤感染细菌及细菌战剂的同时侦检.经济简便性，多种病原体在同一反应管内同时检出，将大大的节省时间，节省试剂，节约经费开支，为临床提供更多更准确的诊断信息.,119,不对称PCR,asymmetricPCR用不等量的一对引物，PCR扩增后产生大量的单链DNA(SSDNA)。这对引物分别称为非限制引物与限制性引物，其比例一般为501001.,120,0.5pmol，限制引物,25-50pmol，非限制引物,双链,单链,在PCR反应的最初1015个循环中，其扩增产物主要是双链DNA，但当限制性引物(低浓度引物)消耗完后，非限制性引物(高浓度引物)引导的PCR就会产生大量的单链DNA.,121,不对称PCR的应用,不对称PCR制备的ssDNA，主要用于核酸序列测定.用于探针的制备,122,反转录PCR,reversetranscriptionPCR，RT-PCR，RNA-PCR以mRNA为模板，在逆转录酶的作用下合成出cDNA第一链；cDNA以自身为模板合成出互补第二链,123,反转录酶,mRNA,cDNA第一链,合成,变性退火,延伸,cDNA,124,RT-PCR,125,RT-PCR,126,RT-PCR操作步骤,127,RT-PCR的应用,克隆cDNA。检测RNA合成cDNA探针用寡聚胸腺嘧啶（polyT）和另一随机引物配对，可以制备基因表达文库,128,常用的反转录酶,RT-PCR的关键步骤是RNA反转录用作模板的RNA可以是总RNA，但不能混有DNA、Pr等，尤其不能混有RNA酶，因此要严格进行RNA纯化AMV：鸟类成髓细胞白血病病毒反转录酶MML：莫洛尼鼠类白血病病毒反转录酶,129,反向PCR,reversePCR常规PCR只能扩增两端序列已知的目的基因，即两引物之间DNA片段。反向PCR是用反向的互补引物来扩增两引物以外的未知序列的片段,130,原理,选择已知序列内部没有切点的限制性内切酶对靶DNA两端序列进行酶切，最好使所产生的带有靶DNA的区段不大于2-3kb。用连接酶使带有粘性末端的靶序列环化连接用一对反向引物（outwardly-facingprimers）进行PCR，其扩增产物将含有两引物外未知序列，从而对未知序进行分析研究.,131,酶切位点,酶切,引物1,引物2,连接,PCR,132,反向PCR的应用,对染色体DNA进行染色体步查（ChromosomeWalking）但能被反向PCR扩增的DNA长度是有限的，因此它只能沿着染色体分子作较短的步移用于对未知序列的测序,133,锚定PCR,AnchoredPCR，A-PCR用酶法在反转录的cDNA3端加上一段已知序列，然后以此序列为引物结合位点，对该cDNA进行PCR扩增的技术,134,GGGG,GGGG,CCCC,GGGG,CCCC,mRNA,cDNA,逆转录酶,末端转移酶,引物,PCR,锚定引物,特定引物,135,锚定PCR的应用,构建低丰度的cDNA文库分离与一段已知序列相邻的未知序列扩增特定的cDNA片段可用于制备探针,136,修饰引物PCR,ModifiedprimerPCRPCR引物在合成过程中对5端进行修饰，不但不影响扩增反应的进行，而且方便了产物的分析还可将一些信号分子，如荧光素、生物素等连接到引物的5末端引物修饰类型,137,彩色PCR,ColorPCR着色互补PCR，colorcomplementationPCR荧光PCR，fluroscentPCR用不同颜色的荧光染料标记引物的5端，因而扩增后的靶基因序列分别带有引物5的染料，通过电泳或离心沉淀，肉眼就可根据不同荧光的颜色判定靶序列是否存在及其扩增状况,138,荧光染料,绿色荧光：JOE、FAM红色荧光：TAMRA、ROX蓝色荧光：COUM,139,荧光的产生,JOE：520nm激发，产生545nm绿色荧光FAM：438nm激发，产生520nm绿色荧光TAMRA：545nm激发，产生580nm红色荧光ROX：585nm激发，产生650nm红色荧光COUM：350nm激发，产生450nm蓝色荧光,140,141,彩色PCR的应用,检测基因的突变、基因缺失染色体重排或转位微生物的型别鉴定为核酸序列测定自动化创造了条件,142,免疫PCR,immuno-PCR利用抗原-抗体反应的特异性和PCR扩增反应的极高灵敏性来检测抗原，尤其适用于极微量抗原的检测,143,免疫PCR的步骤,抗原-抗体反应与嵌合连接分子结合PCR扩增嵌合连接分子中的DNA（一般为质粒DNA）.该技术的关键环节是嵌合连接分子的制备嵌合连接分子有两个结合位点，一个与抗原抗体复合物中的抗体结合，一个与质粒DNA结合，形成抗原抗体-连接分子-DNA复合物，通过PCR扩增DNA来判断是否存在特异性抗原.,144,链亲和素-蛋白A嵌合分子,145,免疫-PCR优点,特异性较强，因为它建立在抗原抗体特异性反应的基础上.敏感度高，PCR具有惊人的扩增能力，免疫PCR比ELISA敏感度高105倍以上，可用于单个抗原的检测.操作简便，PCR扩增质粒DNA比扩增靶基因容易得多，一般实验室均能进行.,146,原位PCR,InsituPCR，涂片PCR，slidePCR1990年，Hasse等建立原位PCR就是在组织细胞里进行PCR反应，它结合了具有细胞定位能力的原位杂交和高度特异敏感的PCR技术的优点，是细胞学科研与临床诊断领域里的一项有较大潜力的新技术,147,原位PCR方法,实验用的标本是新鲜组织、石蜡包埋组织、脱落细胞、血细胞等.固定组织或细胞：将组织细胞固定于预先用四氟乙烯包被的玻片上，并用多聚甲醛处理，再灭活除去细胞内源性过氧化物酶蛋白酶K消化处理：用60ug/ml的蛋白酶K将固定好的组织细胞片55消化处理2h后，962min以灭活蛋白酶K,148,原位PCR方法,PCR扩增：在组织细胞片上，加PCR反应液，覆盖并加液体石蜡后，直接放在扩增仪的金属板上，进行PCR循环扩增.有的基因扩增仪带有专门用于原位PCR的装置.杂交：PCR扩增结束后，用标记的寡核苷酸探针进行原位杂交.显微镜观察结果.,149,原位PCR的优点,原位PCR既能分辩鉴定带有靶序列的细胞，又能标出靶序列在细胞内的位置特异性和敏感性高于一般的PCR和原位杂交.用于基因重排和突变的检测与分析，如检测病毒感染的细胞，或异常的基因神经细胞含脂类较高，通透性差，目前尚不适用于原位PCR,150,重组PCR,recombinantPCR使两个不相邻的DNA片段重组在一起的PCRMullis等于1986年报道了由PCR扩增的两个DNA片段通过重组合后再经延伸而制备出新的DNA分子,151,PCR,PCR,变性退火,延伸,重组DNA,152,第四节PCR技术的应用,一、PCR在分子生物学中的应用二、PCR在临床医学中的应用三、PCE在法医学中的应用,153,一、PCR在分子生物学中的应用,DNAclone引入点突变、缺失或插入重组PCRDNA序列的测定,154,DNAclone,连接转化,PCR,酶切,载体,酶切,重组质粒,155,引入点突变、缺失或插入,模板：ACCGT引物：TCGCA模板：ACCGT引物：TGGACA模板：ACCGT引物：TCCA,156,重组PCR,见前面用于基因工程研究,157,DNA序列的测定,化学法和双脱氧法双链直接测序双链克隆后测序基因扩增转录测序不对称PCR产生单链测序,158,二、PCR在临床医学中的应用,遗传性疾病的基因诊断PCR技术在检测病毒性疾病中的应用PCR技术在检测癌基因中的应用,159,遗传性疾病的基因诊断,目前有遗传病4000多种利用已知的基因结构合成一对引物是PCR诊断遗传病的最基本条件，也就是说，遗传病的基因结构必须部分或全部清楚.,160,地中海贫血病的病因,地中海贫血是由珠蛋白链合成不平衡所导致的一类遗传性疾病。基因缺失插入或置换造成基因的不表达或表达水平低下RNA加工、成熟、翻译异常或mRNA无功能或合成不稳定的珠蛋白-地中海贫血和-地中海贫血,161,和珠蛋白基因的突变类型,基因的突变：以缺失型突变最为常见，其缺失的范围可从两个基因均缺失至一些小片段的缺失，基因的另一突变即为单碱基置换，目前已发现的突变有18种以上，它包括错义突变、无义突变、剪接部位突变及起始信号突变.基因的突变：以点突变为主，即单核苷酸置换是-基因的主要突变类型，亦有碱基的括入和缺失，,162,传统的产前诊断方法,取胎儿脐带血、绒毛等为样品，通过DNA分析进行诊断或取胎儿血在体外培养后用PAGE测定各珠蛋白链的合成速率比标本用量大，部分样品只能在胎儿中期取样，分析操作耗时、成本高,163,PCR产前诊断胎儿标本的来源,羊水穿刺，在15周后可经母亲腹壁穿刺获羊水，其内含大量胎儿细胞，5-10ml羊水即可获得足够量的PCR分析DNA样品.绒毛采样，在早期(9-12周)经阴道在B超引导采取绒毛样品，它含有丰富的DNA.胎儿血液采集：胎儿脐静脉穿刺胎儿活检：17-19周进行穿刺取样，亦可经胎儿镜取样母外周血分离胎儿细胞，目前已用于胎儿性别的预测.宫颈刷取细胞.着床前取细胞,164,基因全部缺失的PCR诊断,基因全部缺失所引起的临床表现为HbBarts胎儿水肿综合征PC01：5TACTGTAGATACCCGTGTACAA3PC02：5ATCARGGAAACATAGTAAT3PC03：5ACACAACTGTGTTACCTAGC3PC04：5CAACTTCATCCACGTTCACC3扩增片段：PC01-PC02；136；PC03-PC04；110；扩增条件：93(30)；45(30)；65,165,基因全部缺失的PCR诊断,PC03-PC04扩增产物位于链上，作为内对照结果判定：在正常人PCO1-PCO2扩增片段为136bp，PCO3-PCO4为110bp，而HbBarts胎儿水肿综合征仅有PC03-PCO4的110bp扩增片段，而无PCO1和PCO2的136bp扩增产物,166,PCR诊断,正常内对照,Barts水肿,PCR故障,CK,110,136,167,168,PCR技术在地贫基因诊断中的应用,地贫的基因突变主要是单碱置换。目前在世界范围内发现的单碱基置换达160余种，其中在中国发现的有21种珠蛋白基因的突变主要为单碱基碱置换，因此诊断途径与地贫完全不同，其诊断的主要目的即检出点突变.,169,PCR-寡核苷酸探针斑点杂交(PCR-ASO),如果一个基因的突变部位，性质经测序分析已经阐明，即可用该方法直接检测突变利用人工合成的寡核苷酸片段（一般为19bp）作为探针，与经PCR扩增获得的靶DNA进行杂交，在严格控制杂交条件的前提下，通过斑点杂来检测PCR产物中有无相应突变，即探针与靶DNA片段之间只要有一个碱基不相互配对或错记，就能检出,170,PCR-寡核苷酸探针斑点杂交,探针：一般合成两个，一个为正常序列，另一个含有突变位点，前者与正常靶DNA完全互补，后者只与突变DNA互补。该探针称为等位特异寡核苷酸探针(allelespecificoligonucleotideprobe，ASO探针).点膜与杂交放射自显影,171,PCR-ASO检测结果,1234,abc,A,B,C,A：样品在膜上的位置，2C为正常人，1