酶的概述PPT课件

.,1,酶的概述,.,2,第一部分酶学概论,.,3,一、酶的概念及其作用特点1、酶是一类具有高效率、高度专一性、活性可调节的生物催化剂。,.,4,2、酶与非生物催化剂相比的几点共性：催化效率高，用量少（细胞中含量低）。加快反应速度但不改变化学反应平衡点。降低反应活化能。反应前后自身结构不变。,.,5,3、酶催化反应的特点（1）、催化效率更高酶催化反应速度是相应的无催化反应的108-1020倍，并且高出非酶催化反应速度至少几个数量级。,.,6,（2）、专一性高酶对反应的底物和产物都有极高的专一性，几乎没有副反应发生。（3）、反应条件温和常温、常压，中性pH环境。,（4）、活性可调节别构调节、酶的共价修饰、酶的合成、活化与降解等。（5）、酶的催化活性离不开辅酶、辅基、金属离子,.,7,二、酶的化学本质及其组成（一）酶的化学本质绝大多数酶是蛋白质证据（1）酸水解的产物是氨基酸，能被蛋白酶水解失活；（2）具有蛋白质的一切共性，凡是能使蛋白质变性的因素都能使酶变性。少数酶是RNA（核酶）,.,8,（二）酶的化学组成单纯酶类(simpleenzyme)：仅由蛋白质组成脲酶、溶菌酶、淀粉酶、脂肪酶、核糖核酸酶等缀合酶类（conjugatedenzyme):全酶（holoenzyme)=脱辅基酶（apoenzyme)+辅因子(cofactor)：超氧化物歧化酶（Cu2+、Zn2+）、乳酸脱氢酶（NAD+）,.,9,酶的辅助因子主要有金属离子和有机化合物金属离子：Fe2+、Fe3+、Zn2+、Cu+、Cu2+、Mn2+、Mn3+、Mg2+、K+、Na+、Mo6+、Co2+等。有机化合物：NAD，NADP，FAD，生物素，卟啉等辅酶(coenzyme)：与酶蛋白结合较松，可透析除去。辅基(prostheticgroup)：与酶蛋白结合较紧。,.,10,酶蛋白决定酶专一性，辅助因子决定酶促反应的类型和反应的性质。,.,11,三、单体酶、寡聚酶、多酶复合体、多酶融合体1、单体酶由一条或多条共价相连的肽链组成的酶分子牛胰RNase124a.a单链鸡卵清溶菌酶129a.a单链胰凝乳蛋白酶三条肽链,.,12,2、寡聚酶含相同亚基的寡聚酶：苹果酸脱氢酶（鼠肝），2个相同的亚基含不同亚基的寡聚酶：琥珀酸脱氢酶（牛心），2个亚基寡聚酶中亚基的聚合，有的与酶的专一性有关，有的与酶活性中心形成有关，有的与酶的调节性能有关。,.,13,3、多酶复合体由两个或两个以上的酶，靠非共价键结合而成，其中每一个酶催化一个反应，所有反应依次进行，构成一个代谢途径或代谢途径的一部分。大肠杆菌丙酮酸脱氢酶复合体由三种酶组成：丙酮酸脱氢酶（E1）以二聚体存在29600二氢硫辛酸转乙酰基酶（E2）70000二氢硫辛酸脱氢酶（E3）以二聚体存在25600012个E1二聚体249600024个E2单体24700006个E3二聚体1256000总分子量：560万,.,14,4、多酶融合体（多功能酶）一条多肽链上含有两种或两种以上催化活性的酶，往往是基因融合的产物。例如：天冬氨酸激酶I-高丝氨酸脱氢酶I融合体（双功能酶）该酶是四聚体4，每条肽链含两个活性区域：N-端区域是Asp激酶，C端区域是高Ser脱氢酶,.,15,四、酶的分类及命名,.,16,（一）、习惯命名1.依据底物来命名（绝大多数酶）：蛋白酶、淀粉酶2.依据催化反应的性质命名：水解酶、转氨酶3结合上述两个原则命名：琥珀酸脱氢酶。4.有时加上酶的来源胃蛋白酶、牛胰凝乳蛋白酶,.,17,（二）、国际系统命名基本原则：明确标明酶的底物及催化反应的性质（底物为水时可略去不写）。酶国际系统命名法举例谷丙转氨酶的系统名称：丙氨酸：-酮戊二酸氨基转移酶,.,18,六、酶的活力测定与分离纯化1、酶活力与酶促反应速度酶活力：在一定条件下，酶催化某一反应的反应速度（一般测初速度）。酶促反应速度：单位时间、单位体积中底物的减少量或产物的增加量。单位：浓度/单位时间,.,19,研究酶促反应速度，以酶促反应的初速度为准(底物消耗5%）。,.,20,2、酶的活力单位（U）国际单位（IU单位）：在最适反应条件下，每分钟催化1mol底物转化为产物所需的酶量，称一个国际单位（IU），1IU=1mol/min国际单位（Katal,Kat单位）：在在最适反应条件下，每秒钟催化1mol底物转化为产物所需的酶量，称Kat单位1Kat=60*106IU,.,21,最适条件：最适温度（25或37，最适pH、最适缓冲液离子强度、最适底物浓度。,.,22,3、酶的比活力Specificactivity每毫克酶蛋白所具有的酶活力。单位：U/mg蛋白质。酶的比活力是分析酶的含量与纯度的重要指标。,.,23,一个酶的分离纯化分为4步。步骤1234总活力（U）6432总蛋白质（mg）201052比活力（U/mg）6/204/103/52/2酶的提纯过程中，总蛋白减少，总活力减少，比活力增高。酶的纯化倍数：酶的回收率：100%,.,24,4、酶活力的测定方法分光光度法荧光法同位素法电化学法,.,25,第二部分酶促反应动力学,研究酶促反应的速度以及影响酶促反应速度的各种因素，包括底物浓度、酶浓度、pH、温度、激活剂与抑制剂等。,.,26,一、化学反应的基础化学热力学化学动力学,.,27,二、底物浓度对酶促反应速度的影响（一）中间复合物假说与米式方程,.,28,1903Henri,V,sucrose,V,.,29,1、中间产物假说：酶与底物先络合成一个中间产物，然后中间产物进一步分解成产物和游离的酶。,.,30,2、米式方程：Michaelis和Menten1913年,Ks为底物解离常数（底物常数）,.,31,（二）米式方程的导出：1、早年的米式方程基于快速平衡假说,在反应的初始阶段，S远远大于E，因此，S可以认为不变。因为研究的是初速度，P的量很小，由P+EES可以忽略不记。,游离的酶与底物形成ES的速度极快（快速平衡），而ES形成产物的速度极慢，故，ES的动态平衡与ESP+E没有关系（既K1、K2K3）,.,32,ES的生成速度：K1（E-ES）SES的分解速度：K2ESK1（E-ES）S=K2ES,反应速度：,KS现在称为底物常数,.,33,2、“稳态平衡假说”及其对米式方程的发展：Briggs和Haldane1925,ES的动态平衡不仅与E+SES有关，还与ESP+E有关。稳态平衡假说的贡献在于发展了快速平衡学说的第点。,所谓“稳态”：ES的形成速度与分解速度相等、ES的浓度保持不变的反应状态,.,34,ES生成速度：k1（E-ES）SES分解速度：k2ES+k3ES以上两个速度相等：k1（E-ES）S=k2ES+k3ES,用稳态假说推导米式方程：,.,35,Vmax=k3E,（米氏常数）,当Km及Vmax已知时，根据米氏方程可确定酶反应速度与底物浓度的关系。,（单体酶）,（寡聚酶）,.,36,当SKm时,当SKm时,当S=Km时,.,37,（三）米式方程中各参数的意义1、快速平衡假说与稳态平衡假说的实质区别,当K1、K2K3时，即ESP+E是整个反应平衡中极慢的一步：,“稳态平衡=快速平衡+慢速平衡”：,当ESP+E极慢（K3/K1极小）时，稳态平衡基本等于快速平衡,.,38,2、Km的物理意义当反应速度v=1/2Vmax时，Km=S，Km的物理意义是：当反应速度达到最大反应速度一半时底物的浓度。单位：molL-1或mmolL-1Km是酶的特征常数之一。一般只与酶的性质、底物种类及反应条件有关，与酶的浓度无关。,.,39,（四）Km和Vmax的求解方法1、Lineweaver-Burk双倒数作图法,.,40,三、pH对酶促反应速度的影响1.pH影响酶活力的因素影响酶蛋白构象，过酸或过碱会使酶变性。影响酶和底物分子解离状态，尤其是酶活性中心的解离状态，最终影响ES形成。影响酶和底物分子中另外一些基团解离，这些基团的离子化状态影响酶的专一性及活性中心构象。,.,41,2酶的最适pH和稳定性pH最适pH：使酶促反应速度达到最大时的介质pH。,.,42,最适pH与底物种类、浓度及缓冲液成分有关。虽然大部分酶的pH酶活曲线是钟形，但也有半钟形甚至直线形。,.,43,四、温度对酶促反应速度的影响。1最适温度及影响因素温度对酶促反应速度的影响有两个方面：提高温度，加快反应速度。提高温度，酶变性失活。温度系数Q10：温度升高10，反应速度与原来的反应速度之比，大多数酶的Q10一般为12。温血动物的酶，最适温度3540，植物酶最适温度4050，细菌TaqDNA聚合酶70。最适温度不是酶的特征常数，它与底物种类、作用时间、pH、离子强度等因素有关。,.,44,.,45,2、酶的稳定性温度在某一时间范围内，酶活性不降低的最高温度称该酶的稳定性温度。酶浓度高、不纯、有底物、抑制剂和保护剂会使稳定性温度增高。酶的保存：液体酶制剂可以利用上述5种因素中的几种，低温短暂保存。冻干粉可在在低温冰箱中较长期保存。,.,46,五、激活剂对酶促反应速度的影响凡是能提高酶活性的物质，都称为激活剂。无机离子或简单有机化合物对酶的激活。无机离子或蛋白酶对酶原的激活。,.,47,1、无机离子的激活作用（1）金属离子：K+、Na+、Mg2+、Zn2+、Fe2+、Ca2+（2）阴离子：CI-、Br-、PO43-（3）氢离子不同的离子激活不同的酶。不同离子之间有拮抗作用和可替代作用，如Na+与K+、Mg+与Ca+之间常常拮抗，但Mg+与Zn+常可替代。激活剂的浓度要适中，过高往往有抑制作用，150mM,.,48,2、简单有机分子的激活作用还原剂（如Cys、还原型谷胱甘肽）能激活某些活性中心含有SH的酶。金属螯合剂（EDTA）能去除酶中重金属离子，解除抑制作用。,3、蛋白酶对酶原的激活,.,49,六、抑制剂对酶促反应速度的影响变性作用(denaturation)：抑制作用(inhibition)：使酶活力下降或丧失但并不引起酶蛋白变性变性剂没有选择性抑制剂有不同程度的选择性,.,50,研究抑制剂对酶的作用有重大的意义：（1）药物作用机理和抑制剂型药物的设计与开发（2）了解生物体的代谢途径，进行人为调控或代谢控制发酵（3）通过抑制剂试验研究酶活性中心的构象及其化学功能基团，不仅可以设计药物，而且也是酶工程和化学修饰酶、酶工业的基础,.,51,（五）一些重要的抑制剂,.,52,1、不可逆抑制剂：（1）、非专一性不可逆抑制剂与酶的活性中心以及活性中心外的某一类或几类必需基团反应,.,53,、有机磷的酰化物二异丙基磷酰氟（DFP，神经毒气）和许多有机磷农药。抑制机理：与蛋白酶及酯酶活性中心Ser的OH形成磷脂键。毒理：强烈抑制乙酰胆碱脂酶（神经毒剂）。解毒剂：PAM（解磷定）可以把酶上的磷酰基团除去。,.,54,、有机汞、有机砷化合物抑制机理：使酶的巯基烷化毒理：主要与还原型硫辛酸辅酶反应，抑制丙酮酸氧化酶系统。解毒剂：二巯基丙醇、Cys等过量的巯基化合物。,.,55,重金属Ag、Cu、Hg、Cd、Pb能使大多数酶失活，EDTA可解除。烷化物含卤素的烷化物（碘乙酸、碘乙酰胺、卤乙酰苯等）常用于鉴定酶中巯基。氰化物、硫化物、CO与含铁卟啉的酶中的Fe2+结合，阻抑细胞呼吸,.,56,、青霉素不可逆抑制糖肽转肽酶、还原剂巯基乙醇、二硫苏糖醇等巯基试剂还原酶的二硫键含活泼双键试剂（与、反应）乙基顺丁烯二酰亚胺、亲电试剂四硝基甲烷，可使Tyr硝基化。,.,57,（2）专一性不可逆抑制剂此类抑制剂仅仅和某一种酶的活性部位的必需基团反应。,.,58,2、可逆抑制剂,竞争性抑制剂（Competitiveinhibition）许多代谢类似物都是竞争性抑制剂，可用作抗菌药和抗癌药物,.,59,第三部分酶的作用机理,.,60,一酶的活性中心1、活性中心的概念活性中心：酶分子中结合底物并起催化作用的少数氨基酸残基，包括底物结合部位、催化部位频率最高的活性中心的氨基酸残基：Ser、His、Cys、Tyr、Asp、Glu、Lys。不需要辅酶的酶：活性中心是酶分子在三维结构上比较靠近的少数几个氨基酸残基或是这些残基的某些基团。需要辅酶的酶：辅酶分子或辅酶分子的某一部分结构往往就是活性中心的组成部分。,.,61,接触残基：R1、R2、R6、R8、R9、R163辅助残基：R3、R4、R5、R164、R165结构残基：R10、R162、R169非贡献残基：其它,.,62,.,63,二酶作用专一性的解释1、锁钥模型(lock-keyhypothesis)Fisher1894酶活性中心的形状与底物分子形状互补。底物分子或其一部分像钥匙一样，专一地插入酶活性中心，通过多个结合位点的结合，形成酶底物复合物。酶活性中心的催化基团正好对准底物的有关敏感键，进行催化反应。,.,64,.,65,.,66,锁钥模型较好地解释了立体异构专一性。但不能解释可逆反应。,.,67,2、诱导楔合模型(induced-fithypothesis)Koshland1958酶分子与底物分子接近时，酶蛋白质受底物分子诱导，构象发生有利于与底物结合的变化，酶与底物在此基础上互补楔合，进行反应。,.,68,.,69,三、高效性的机理1、邻近效应与定向效应变分子间反应为分子内反应邻近效应：酶与底物形成中间复合物后使底物之间、酶的催化基团与底物之间相互靠近，提高了反应基团的有效浓度。定