DNA斑点杂交系列(一)-实验方法文档

DNA斑点杂交系列(一)-实验方法点杂交（Dot blot）是将被检标本点到膜上，烘烤固定。这种方法耗时短，可做半定量分析。一张膜上可同时检测多个样品，为使点样准确方便，市售有多种多管吸印仪（Manifold），如Minifold和、Bio-Dot（Bio-Rad）和Hybri-Dot,它们有许多孔，样品加到孔中，在负压下就会流到膜上呈斑点状或狭缝状。反复冲洗进样孔，取出膜烤干或紫外线照射以固定标本，这时的膜就可以进行杂交。（1）DNA斑点杂交：先将膜在水中浸湿，再放到15SSC中。将DNA样品溶于水或TE,煮沸5min,冰中速冷。用铅笔在滤膜上标好位置，将DNA点样于膜上，每个样品一般点5l（2-10g DNA）。将膜烘干，密封保存备用。（2）RNA斑点杂交：与上法类似，每个样品至多加10g总RNA（经酚/氯仿或异硫氰酸胍提取纯化），方法是将RNA溶于5l DEPC水，加5l甲醛/SSC缓冲液（10SSC中含6.15mol/L甲醛），使RNA变性，然后取5-8l点样于处理好的滤膜上，烘干。（3）完整细胞斑点杂交：应用类似检测细菌菌落的方法，可以对细胞培养物的特异序列进行快速检测，将整个细胞点到膜上，经NaOH处理，使DNA暴露、变性和固定，再按常规方法进行杂交与检测。有人曾用此法从105个培养细胞中检测到至少5pg的Epstein-Barr病毒DNA.完整细胞斑点印迹法可以用于筛选大量标本，因为它使细胞直接在膜上溶解，所以DNA含量甚至比常用的提取法还高，又不影响与32P标记的探针杂交，但它不适用于非放射性标记探针，因为DNA纯度不够，会产生高本底。DNA斑点杂交系列(二)-实验举例一、实验原理用地高辛标记的HCV RNA探针检测HCV RT-PCR产物。二、实验步骤1. 处理：将尼龙膜浸泡于20SSC中吸足液体后，夹在两层滤纸中37烘烤20-30 min。（将尼龙膜置入烤箱后立即进行下一步操作）2. 变性：【原理】 使DNA样品变性，即双链DNA单链DNA。将待测DNA样品（HCV经RT-PCR扩增产物；HBV的PCR扩增产物作为阴性对照，每组两种样品各10L）置于PCR仪中100加热10min,立即置冰中，并置于-20冰箱中骤冷5min。（每一排共三组的样品点在同一张尼龙膜上。）3. 点样：【原理】 使样品中的DNA与膜结合牢固。将上述变性后的样品各2L点在尼龙膜的毛面上，室温下风干后，于烤箱中120烘烤30 min。4. 预杂交：【原理】 封闭杂交膜上多余的非特异性DNA结合位点。将杂交膜封入杂交袋中（每两组的膜背靠背封在一个杂交袋中），做好剪角标记（勿过大）。用1000L加样器，加入预杂交液（Dig Easy Hyb），每组5mL全部加完，使尼龙膜恰恰漂起即可，若5mL预杂交液不足，可适当补加。除去气泡，置42恒温摇床上，轻轻振摇30min-60min. 5. 杂交液制备：用预杂交液将探针按100ng/mL浓度稀释，即为杂交液。 （已准备好）6. 杂交：剪开杂交袋一个小角，倾去预杂交液，加入杂交液2-3mL,除去气泡，封口。置50恒温摇床上，轻轻振荡过夜。7. 洗膜：【原理】洗去未结合的探针，否则会导致过高的本底。（1）回收杂交液；（2）室温下，用2wash solution洗膜两次，每次5min；（3）将0.1wash solution预热到50洗膜两次，每次15min。8. 封闭：取出膜，在含有30mL Buffer的培养皿中浸泡1分钟平衡后，转入30mL Buffer中，室温作用30-60min。【原理】封闭杂交膜上非特异性的蛋白结合位点。 （在此阶段末期，准备下一步的抗体稀释。稀释方法：加1L Anti-DIG-AP到10mL Buffer后轻轻混匀，4 可保存12h.）9. 酶联抗体结合：将杂交膜封入一个新的杂交袋中，加入3mL Anti-DIG-AP/ Buffer中室温作用30min，经常摇动，使酶联抗体与地高辛结合。10.洗膜：（1）取出膜，将膜放入含有30mL Buffer的培养皿中，洗膜两次，每次15min。【原理】洗去未结合的酶联抗体。（2）取出膜，将膜放入含有20mL Buffer的培养皿中平衡2min。11.显色：（1）将45L NBT sol