分子生物学——复制.ppt

基因信息的传递,地球生命的传奇,生命简史,TheBigBang150200亿年MilkyWaygalaxy136亿年solarsystem46亿年,TheLifeStory40亿年,古细菌、真细菌、真核原生生物,TheLifeStory40亿年,寒武纪生命大爆炸56亿年多细胞生物植物登陆4亿年动物登陆3.6亿年哺乳动物诞生2.3亿年灵长类动物诞生5500万8000万年人类直系祖先诞生700万500万现代人诞生510万年人类文明史1万年,科学家复原的“杜马伊”形象,学科简史,1859年CharlesRobertDarwin,1865年MendelsPea1941年OneGene,OneEnzyme1953年DNAdoublehelix1966年GeneticCodeCracked1972年FirstrecombinantDNA1982年Firsttransgenicmice2003年人类基因组测序基本完成,分子生物学发展阶段,准备和酝酿阶段蛋白质是生命的主要基础物质生物遗传的物质基础是DNA现代分子生物学的建立和发展阶段遗传信息传递中心法则的建立,分子生物学发展阶段,初步认识生命本质及改造生命的深入发展阶段重组DNA技术的建立和发展基因组研究的发展单克隆抗体及基因工程抗体的建立和发展基因表达调控机理细胞信号转导机理研究成为新的前沿领域,第十章DNA的生物合成BiosynthesisofDNA,复制DNA遗传信息亲代子代；转录和翻译基因表达基本的三类RNA制造蛋白质，决定生物的表现型,中心法则thecentraldogma,中心法则的补充,RNA病毒复制RNA遗传信息亲代子代逆转录RNADNA,DNAdependentDNApolymeraseDDDPDNAdependentRNApolymeraseDDRPRNAdependentRNApolymeraseRDRPRNAdependentDNApolymeraseRDDP,第一节复制基本规律复制的特点,一、半保留复制semiconservativereplication亲代DNA链为模板，合成子代DNA链子代DNA双链中含一条亲代DNA链,DNA复制机制的三种假说,使子代DNA与亲代DNA不同,1958年M.Messelson和F.Stahl15N培养基14N培养基提取DNA，作密度梯度离心,复制基本方式的证明,阐明半保留复制的意义,从原则上保证了遗传的相对保守性奠定了DNA是遗传物质的地位,二、复制起始点originDNA复制从特定的位点起始（复制子）富含AT原核生物一个真核生物多个,三、双向复制bidirectionalreplication,复制起始点为中心，向两个方向同时进行复制微生物中，也可进行单向复制如滚环复制,四、需要引物primerDNAPolymerase不能从头开始只能延伸已有核酸链引物酶Primase合成一小段RNA链(引物)提供3端自由羟基（3-OH）引物的大小原核生物:50100个核苷酸真核生物：约为10个核苷酸,五、半不连续复制DNA聚合酶合成方向53DNA双链逆向平行DNA的解链和复制同时进行,53,ATATTTTTTATATATATTTTTT,领头链(leadingstrand)连续随从链(laggingstrand)不连续冈崎片断(Okazakifragment)原核生物1K2K真核生物100,第二节酶学和拓扑学变化DNA复制的条件,底物&模板解旋解链DNA聚合酶DNA连接酶,底物substrate模板template,dATP，dGTP，dCTP，dTTPDNA复制是模板依赖性的,解链及拓扑学变化,解螺旋酶（unwindingenzyme）解链酶或rep蛋白解开DNA双链2ATP/bpbasepair,解螺旋酶,引发体和RNA引物,引发体:引发前体+引物酶引发前体:由若干蛋白因子聚合而成DnaA蛋白识别复制起始点，并具有ATPase活性。引物酶特殊的DDRP,单链DNA结合蛋白,单链DNA结合蛋白（singlestrandbindingprotein,SSB）又称螺旋反稳蛋白（HDP）稳定ssDNA，便于复制保护ssDNA，免受核酸酶的降解,拓扑异构酶(topoisomerase),拓扑异构酶切断DNA双链中的一条链松开双螺旋后再将DNA链连接起来避免出现链的缠绕。拓扑异构酶可切断DNA双链使DNA的超螺旋松解后，再将其连接起来。,解链过程中正超螺旋的形成,DNA聚合酶(DDDP),（一）种类和生理功能：原核生物DNA聚合酶（pol）1958年A.KornbergDNA聚合酶（pol）DNA聚合酶（pol）主力,pol由十种亚基组成全酶的核心部分（核心酶）、和三种亚基组成亚基53聚合活性亚基35外切活性保证DNA复制的精确性/保真性pol无53外切活性,外切酶活性的方向,ATTAGCACCAMP+TTAGCACCCMP+ATTAGCAC,亚基与模板的结合,亚基形成一个围绕DNA的环状钳,pol单一肽链可被某些蛋白酶水解为两个片段大片段称为Klenowfragment常用的工具酶,323个氨基酸,小片段,5核酸外切酶活性,大片段/Klenow片段,604个氨基酸,DNA聚合酶活性5核酸外切酶活性,N端,C端,DNA-pol,Klenow片段是实验室合成DNA，进行分子生物学研究中常用的工具酶。,原核生物中的三种DNA聚合酶,真核生物五种pol、pol、pol、pol、polpol具有引物酶活性pol主力Pol参与线粒体DNA复制Pol损伤修复、校读和填补缺口pol低保真参与应急修复,三、复制保真性的酶学依据,碱基配对酶学机制：（一）核酸外切酶活性和及时校读（二）碱基选择,（一）DNA-pol的核酸外切酶活性和及时校读,A：切除错配碱基；B：配对正确不表现外切活性。,（二）复制的保真性和碱基选择,DNA聚合酶靠其大分子结构协调非共价（氢键）与共价（磷酸二酯键）键的有序形成。嘌呤的化学结构能形成顺式和反式构型，与相应的嘧啶形成氢键配对，嘌呤应处于反式构型。,碱基配对碱基选择及时校读,DNA复制的保真性,DNA连接酶,DNA连接酶(DNAligase)催化DNA片段之间磷酸二酯键形成,DNA连接酶催化的条件是：3-OH，5-P未封闭的缺口位于双链DNA中（局部）消耗能量原核生物中由NAD+供能真核生物中由ATP供能。,HO,5,3,3,5,DNA连接酶,ATP,ADP,5,3,5,3,DNA连接酶在复制中起接合缺口的作用在DNA修复、重组及剪接中起同样作用基因工程的重要工具酶,DNA聚合酶、DNA连接酶、拓扑酶都形成磷酸二酯键区别？,小结,基本特征originsemiconservativesemi-discontinuousPrimer主要酶DnaB，ssb，topoPrimaseDNAPolymeraseDNAligase,一、复制的起始预引发：DnaA+DnaB+DnaC+SSB解旋解链，形成复制叉：组装引发体：引发引物酶合成引物DnaG拓扑酶解旋,第三节DNA生物合成过程,oriC结构特征,含三组串连重复序列富含AT2对反向重复序列两个相同顺序的互补拷贝在同一DNA链上反向排列而成复制起始识别区,二、复制的延长,（一）聚合子代DNA：DNA聚合酶沿模板链35方向滑动，在53方向聚合子代DNA链,（二）引发体移动：引发体向前移动，解开新的局部双螺旋，形成新的复制叉，随从链重新合成RNA引物，继续进行链的延长。,三、复制的终止,（一）去除引物，填补缺口：DNA聚合酶53外切酶活性53聚合酶活性,（二）连接冈崎片段：在DNA连接酶的催化下，形成最后一个磷酸酯键，将冈崎片段连接起来，形成完整的DNA长链。,（三）真核生物端粒的形成：端粒（telomere）真核生物染色体末端的结构通常膨大成粒状富含G、T的短重复序列构成末端由于引物RNA的水解而可能缩短,端粒酶端粒酶RNA(humantelomeraseRNA,hTR)端粒酶协同蛋白(humantelomeraseassociatedprotein1,hTP1)端粒酶逆转录酶(humantelomerasereversetranscriptase,hTRT),端粒酶(telomerase)的作用机制,第四节逆转录和其它复制方式自学,逆转录病毒逆转录酶cDNA文库其它复制方式滚环复制噬菌体DNAD环复制线粒体DNA,第五节DNA的损伤与修复,DNA损伤突变mutation突变的意义突变的类型突变的效应损伤修复直接修复取代修复涉及DNA的合成,第五节DNA的损伤与修复,DNA一级结构的任何改变称为突变mutation常见形式碱基脱落碱基修饰/去修饰交联链的断裂重组,一、突变的意义,突变是演化的分子基础横向自然界生命的多样性纵向生命的复杂性突变是某些疾病的发病基础,二、引起突变的因素,自发因素：自发脱碱基：糖苷键的自发断裂，引起碱基脱落自发脱氨基C-UA-H复制错配,物理因素：紫外线、电离辐射、X射线X射线和电离辐射常引起DNA链的断裂紫外线常引起嘧啶二聚体的形成TT，TC，CC等二聚体引起复制障碍。,化学因素,脱氨剂：亚硝酸与亚硝酸盐，可加速C生成U，A生成H烷基化剂DNA加合剂苯并芘碱基类似物断链剂过氧化物，巯基化合物,三、DNA突变的类型,点突变转换同类型碱基的取代颠换不同类型碱基的取代镰形红细胞贫血链第6位氨基酸突变CTC-CAC插入增加一碱基对缺失减少一碱基对,碱基的转换,三、DNA突变的类型,复突变插入增加一段顺序缺失减少一段顺序倒位一段碱基顺序发生颠倒移位一段碱基顺序的位置发生改变重排一段碱基顺序与另一段碱基顺序发生交换,DNA突变的效应,同义突变有时引起翻译效率下降误义突变氨基酸顺序改变无义突变多肽链提前终止移码突变(框移突变),四、DNA损伤的修复,DNA损伤的修复方式可分为直接修复和取代修复两大类。,（一）直接修复：1光复活：（lightrepairing）：修复嘧啶二聚体的损伤修复过程光复活酶（photolyase)识别嘧啶二聚体并与之结合形成复合物300600nm可见光获得能量将嘧啶二聚体的丁酰环打开光复活酶从DNA上解离。,2转甲基作用转甲基酶去除修饰的甲基3直接连接DNA连接酶,（二）取代修复：1切除修复(excisionrepairing)：广泛存在的修复机制，可适用于多种DNA损伤的修复核酸内切酶；DNA糖苷酶。,切除修复的过程,DNA糖苷酶切除碱基形成AP位点无碱基的片断核酸内切酶PolDNA连