天然药物化学. 第二章天然药物化学成分提取分离和鉴定的方法和技术

第二章天然药物化学成分提取分离和鉴定的方法和技术,第一节提取方法与技术,天然药物化学的研究是从有效成分或生理活性化合物的提取、分离工作开始的。在进行提取之前，应对所用的药材进行如下的考查：基源（学名）、产地、药用部位、采集时间与方法。还要系统查阅文献，以充分了解和利用前人的经验。（同一品种其含成分含量因产地、取材部位、采集时间、存放条件不同而有变化）,已知成分或已知化学结构类型：一般先查阅有关资料,（工业生产中常用）搜集比较各种提取方法为制定研究工作方案提供依据。,未知有效成分或有效部位：根据预先确定的目标。（实验室常用）以适当的活性测试体系为指导。提取、分离、动物模型筛选。临床验证。,提取,中草药有效成分的提取,提取是研究天然产物的一个重要步骤，常用的方法有溶剂提取法、水蒸气蒸馏法和升华法。,水蒸气蒸馏法：适用于有挥发性的能随水蒸气蒸馏而不被破坏且难溶或不溶于水的成分的提取。例如挥发油类成分。升华法：适用于具有升华性质的成分的提取。例如樟脑、咖啡因等溶剂提取法:选择适当溶剂将中草药中的化学成分从药材中提取出来。,1.概念：根据天然药物中各种化学成分的溶解性能，选择对有效成分溶解度大而对其他成分溶解度小的溶剂，用适当方法将所需化学成分尽可能完全从药材组织中溶解提出的方法。溶剂的提取过程是溶剂对药材组织细胞不断作往返的扩散、渗透、溶解的过程，直至药材组织细胞内外溶液中被溶解的化学成分的浓度达平衡为止。,一、溶剂提取法,2.溶剂提取法的提取原理：根据化合物在极性相似的溶剂中有较好的溶解性即“相似者相溶”这一原理进行的。,极性从低到高的顺序依次是：石油醚二硫化碳苯无水乙醚三氯甲烷乙酸乙酯正丁醇丙酮乙醇甲醇乙腈水10时,则须萃取10-12次；2时，要想实现基本分离，须作100次以上的萃取才可以。1时，则KAKB。意味着两者性质极其相近，用分配无法实现分离。,2.分离难易与分离因子,3.逆流连续萃取法：是一种连续的两相溶剂萃取法。其装置可具有一根、数根或更多的萃取管。利用两种互不相溶的溶剂相对密度的不同，使相对密度小的相液作为流动相，逆流连续穿过相对密度大的作为固定相的相液，借以交换溶质而达到分离的目的。优点：操作简便，萃取较完全，避免乳化。,4.逆流分溶法（CCD）此法相当于多次萃取。,在No.0漏斗中溶入溶质并加入流动相。振摇使两相溶剂充分混合，静置分层后，分出流动相，令其移入No.1管，再在No.0管中补加新鲜流动相，再次振摇混合，静置分层并进行转移。如此连续不断地操作下去，溶质即在两相溶剂中，不断地重新分配并达到分离的目的。,流动相液滴垂直上下，经过固定相液,5.液滴逆流色谱（DCCC）,6.纸色谱法以滤纸为支持剂，滤纸上吸着的水为固定相，用一定的溶剂系统为移动相进行展开，利用混合物中各成分分配系数的差异达到分离的目的。纸色谱的原理与液-液萃取基本相同。,操作技术点样：点样量一般为几毫克至几十毫克，点样量大则点样原点宜大些。展开：上行法或圆形法显色：先在日光或紫外灯下观察有无颜色或荧光，再喷洒相应的显色剂。计算比移值（Rf）：原点至色谱斑点中心的距离/原点至溶剂前沿的距离,7.液-液分配柱色谱,固定相涂覆于硅胶等多孔载体上，装柱流动相通过色谱柱进行洗脱物质在两相溶剂中作逆流分布分配系数不同，被洗脱速度不同,原理：,载体：有硅胶、硅藻上、纤维素粉正相色谱：固定相：水、缓冲液流动相：氯仿、乙酸乙酯、丁醇适合分离水溶性或中等极性的成分：生物碱类、苷类、糖、有机酸。用流动相洗脱时，极性小的成分先被洗脱。反相色谱：固定相：石油醚、异三十烷、石蜡油流动相：水、甲醇适合分离脂溶性化合物：高级脂肪酸、油脂、游离甾体。当用流动相洗脱时，极性大的成分先被洗下来。,加压液相柱色谱为了提高分液速度，缩短分离时间，在加压条件下进行分离，加压液相色谱用的载体多为颗粒直径很小，机械强度与比表面积比一般色谱用的硅胶大的球形微粒，按所加的压力不同可分为：快速色谱（FLC）2个气压，分离范围10mg-g低压液相色谱(LPLC)20个气压，分析型:分离范围ug-10mg制备型:分离范围mg-g,分馏法：利用各沸点不同的化合物，在分馏过程中产生高低不同的蒸气压，从而收集到不同沸点温度的馏分达到分离的目的。,三、根据物质沸点不同进行分离,四、根据物质的吸附性差别进行分离,原理：利用混合物中各成分对吸附剂的吸附能力不同而达到分离，其中固-液吸附用得最多，分为物理吸附，化学吸附及半化学吸附。,物理吸附：分子间力，无选择性，可逆。硅胶、氧化铝、活性炭化学吸附：化学键，选择性较强，常不可逆。硅胶生物碱碱性氧化铝黄酮、蒽醌等半化学吸附：氢键，选择性较弱，多可逆聚酰胺,1.物理吸附的基本规律相似者易于吸附吸附过程中的三大要素：吸附剂、溶质、溶剂,常用吸附剂氧化铝、硅胶、硅藻土、氧化镁、碳酸钙、活性炭等。（1）硅胶：为一多孔性物质，可用通式SiO2H2O表示。它具有多孔性的硅氧环，SiOSi的交键结构，由于其骨架表面具有很多游离、键合和键合活性状态的硅醇基。它能够通过氢键与极性或不饱和分子相互作用，同时能吸附多量的水分。,硅胶含水量与活性的关系活性加入水量（%）I0II5III15IV25V38,活化：100-110oC30min,（2）氧化铝：是一种吸附力很强的亲水性吸附剂，有酸性、碱性和中性三种规格。其吸附活性也与含水量有关氧化铝含水量与活性的比较活性加入水量（%）0361015,活性炭吸附法结晶、重结晶中脱色、脱臭从大量稀水液中浓缩微量物质,（3）活性炭简单吸附法用于物质的浓缩与精制,（4）吸附柱色谱用于物质的分离在实际工作中硅胶与氧化铝柱色谱用的最多。,吸附剂与样品量的比例：3060：1极性小，难以分离的样品：100200：1色谱柱长度与内径比例：1520：1吸附剂的粒度：100目，难以分离的样品可采用200300目。粒度太细，谱带容易扩散，可采用加压色谱。,操作时需要注意的问题,样品与吸附剂的装柱吸附剂选用极性小的溶剂装柱，样品同样以湿法装柱。如果样品在极性小的溶剂中溶解度小，则改用极性大的溶剂溶解后，再用不到装柱量1/20的吸附剂拌匀，于60下加热挥散溶剂，研细后再小心铺在吸附剂柱上。,洗脱用溶剂的极性应逐步增加往往采用梯度洗脱，实践中多用混合溶剂，一般混合溶剂中强极性溶剂的影响比较大。不可随意将极性差别很大的两种溶剂混合使用。对于极性较大的成分常用氯仿-甲醇，按不同比例梯度洗脱，对比较容易洗脱的极性小的成分，可用氯仿-乙醚或氯仿-乙酸乙酯。,为避免发生化学吸附：酸性物质的分离选用硅胶、碱性物质的分离则选用氧化铝为好。碱性物质用硅胶分离时：在洗脱溶剂中加入碱性物质（氨、吡啶、二乙胺等）；酸性物质用氧化铝分离时：洗脱剂中加入醋酸等。通过TLC进行筛选溶剂系统：在TLC展开时使组分Rf值达到0.2-0.3的溶剂系统，为柱色谱的最佳洗脱溶剂系统。,薄层层析是将作为固定相的支持剂均匀地铺在支持板（一般是玻璃板）上，成为薄层，把样品点到薄层上，用适宜的溶剂展开，从而使样品各组分达到分离的层析技术。如果支持剂是吸附剂，如硅胶、氧化铝、聚酰胺等，则称之为薄层吸附层析；如果支持剂是纤维素、硅藻土等，层析时的主要依据是分配系数的不同，则称之为薄层分配层析；如果支持剂是离子交换剂，则称为薄层离子交换层析；薄层若由凝胶过滤剂制成，则称为薄层凝胶层析,薄层层析,薄层板的制作支持板要表面平整、光滑，用前应洗净、干燥。常用的薄层板有硬板(湿板)与软板(干板)之分。在支持剂中加入粘合剂(锻石膏、淀粉等)，调成糊状物所制成的薄层板为硬板，用粉状支持剂直接制成的薄层板为软板。硬板粘牢在支持板上，调成糊状物喷显色剂时不会冲散，可直立展开，而软板只能近水平展开。,层析方法点样距底边1-1.5cm处，用毛细管点样，直径不超过2-3mm展开展式方式与纸层析一样，有上行法、下行法等，但软板薄层只能近水平展开（与水平成10o-20o）。吸附薄层层析所用展开剂主要是低沸点的有机溶剂，一般采用2-3种组分的多元溶剂系统。展开剂的选择是根据被分离物极性、溶剂的极性以及支持剂的特性三方面来考虑。,显色：可先在日光下观察，标出色斑并确定位置，然后在紫外灯下观察和标记，必要时在选择显色剂显色观察。,定性与定量分析薄层层析法用Rf值来表示被分离物质在薄层上的位置，与已知标准物质的Rf对照，可进行定性分析。,定量分析时，可把斑点所在位置的支持剂连同物质一起刮下，然后用适当溶液将其从支持剂上溶解下来，再测定其含量。用目测法比较样品斑点和对照品斑点的颜色深度和面积大小，或测量斑点的面积，可以进行半定量分析和限度检查，有条件时，可用薄层扫描仪进行定量分析。,A,B,CHCl3：MeOH(7:3)CHCl3：MeOH(3:7),吸附剂：硅胶,2.半化学吸附-聚酰胺色谱,聚酰胺吸附色谱属于氢键吸附。对于极性物质和非极性物质都适用，主要适合分离酚类、醌类、黄酮类化合物。,聚酰胺的性质,1.高分子聚合物2.不溶于水和常用的甲醇、乙醇、乙醚及丙酮等有机溶剂3.对碱稳定4.对酸特别是无机酸稳定性差5.可溶于浓盐酸、冰乙酸、甲酸,聚酰胺吸附原理:氢键-半化学吸附,由于分子中含有酰胺羰基及游离胺基，在水溶液中能与含有酚羟基以及羰基的化合物通过氢键结合而被吸附，从而与不含上述基团的化合物分离。,吸附规律：（含水溶剂中）形成氢键的基团数目越多，吸附能力越强易形成分子内氢键者，吸附相应的减弱分子中芳香化程度高，吸附作用增强,各种溶剂在聚酰胺柱上的洗脱能力水甲醇乙醇氢氧化钠水溶液甲酰胺二甲基甲酰胺尿素水溶液,化合物在不同溶剂中的吸附力，随溶剂极性增强而增强水中最强常以水装柱、样品以水溶解上样含水醇中次之醇中最弱常以浓度渐高的含水醇梯度洗脱EtOH-H2O最常用,弱,强,吸附规律：（含水溶剂中）,操作：用水装柱,样品也尽可能的做成水溶液,使其充分被吸附,先用水洗,逐步提高醇的浓度。各种溶剂在聚酰胺柱上的洗脱能力为：水甲醇（乙醇）丙酮氢氧化钠水溶液甲酰胺二甲基甲酰胺尿素水溶液,聚酰胺色谱的应用：,醌类、黄酮类等酚性的制备和分离。脱鞣处理生物碱、萜类、甾类、糖类、氨基酸等极性与非极性化合物的分离也有用途,五、根据物质分子大小差别进行分离,天然有机物的分子大小不同，表现出不同的分子量，故可以根据分子量的大小进行分离。常用的方法有：透析法:利用半透膜的膜孔(透析袋、膀胱墨、火棉胶)凝胶滤过法：利用凝胶的三维网状结构。超滤法：利用分子大小不同引起的扩散速度的差别。超速离心法：利用溶质在超速离心引起的作用下具有不同的沉降性或浮游性。以上方法主要用于水溶性大分子化合物，如蛋白质、核酸、多糖类的脱盐精制及分离工作。,1.透析法：透析法是利用小分子及小离子在溶液中可通过半透膜而大分子及大离子不能通过的性质，借以达到分离。如分离纯化皂苷、蛋白质、多肽、多糖等成分时，即可用透析法除去小分子杂质如无机盐、单糖、双糖等。,2.凝胶滤过法（gelfiltration）原理：是利用分子筛分离物质的方法。所用载体葡聚糖凝胶在水中不溶解，但遇水后膨胀成具有三维空间结构的球形颗粒。由于凝胶网孔半径的限制，大分子物质不能渗入凝胶颗粒内部，故只在颗粒间隙移动，并随溶剂一起先从柱底流出，小分子因能自由地渗入到凝胶内部，通过色谱柱时阻力增大，流速变慢，后流出。样品混合物中各个成分因分子大小各异，渗入凝胶颗粒内部的程度不一样，按分子由大到小的顺序先后流出得以分离。,凝胶三维网状结构的分子筛作用按分子量由大到小的顺序分离,凝胶的种类与性质,常用的有葡聚糖凝胶（Sephadex-G）和羟丙基葡聚糖凝胶(Sephadex-LH-20)。(1)Sephadex-G由平均分子量一定的葡聚糖与交联剂（如环氧氯丙烷）交联聚合而成，生成的凝胶颗粒网孔大小取决于所用交联剂的数量及反应条件。加入的交联剂数量越多，网孔越紧密，孔径越小，交联度越高，吸水膨胀也越小，反之，交联度越低，网孔越稀疏，吸水后膨胀也越大。商品型号按交联度大小分类，并以吸水量多少来表示。例如Sephadex-G25.G代表凝胶，后附数字=吸水量X10ml/g。,(2)Sephadex-LH-20为Sephadex-G25经羟丙基化处理后得到的产物OH-OCH2CH2CH2OH，虽然羟基数一样，但碳原子数增加，不仅具有亲水性，也有一定程度的亲脂性。因此不仅可以在水中应用，也可在极性有机溶剂或与水组成的混合溶剂中膨胀，所以可用来分离水溶性成分和非极性成分。,凝胶的处理及再生,SephadexLH-20价格较贵。用过的凝胶可以反复再生使用多次，物质的洗脱过程也就是再生的过程。暂时不使用时可用水洗含水醇洗醇洗，最后浸泡在醇溶液中贮存于磨口瓶中。长期不用时可在以上处理基础上，减压抽干，再用少量乙醚洗净抽干，6080干燥后保存。,六、根据物质解离度不同进行分离,天然有机化合物中，具有酸性，碱性及两性基团的分子，在水中多呈解离状态，可以用离子交换法或电泳技术分离。,1.离子交换法分离物质的原理以离子交换树脂作为固定相，用水或含水溶剂装柱。当流动相流过交换柱时，溶液中的中性分子及不与离子交换树脂交换基团发生交换的化合物将通过柱子从柱底流出，而具有可交换的离子则与树脂上的交换基团进行离子交换并被吸附到柱上，随后改变条件并用适当溶剂从