第11章组织培养.ppt

第三篇植物细胞工程,植物组织培养植物的快速繁殖单倍体诱导与单倍体育种植物胚胎培养体细胞胚胎发生和人工种子植物原生质体融合技术植物染色体工程植物转基因技术,第11章植物组织培养,植物组织培养概念发展历史组织培养的理论基础植物组织培养培养基,植物组织培养概念,定义：在含有营养物质及植物生长物质的培养基中，培养离体植物组织，并诱导使其长成完整植株的技术。植物组织培养是二十世纪发展起来的新技术，近三十年来由于组织培养基础理论研究的深入，发展极为迅速，几乎以植物为研究对象的各个分支学科都在广泛进行组织培养。,植物组织培养与细胞培养的区别,组织培养：指从机体内取出组织或细胞，模拟机体内生理条件，在体外进行培养，使之生存或生长成组织。细胞培养：指动植物细胞在体外条件下的存活或生长，此时细胞不再形成组织。植物组织培养：主要指用于植物快速繁殖的组培技术。植物细胞培养：指以生产次生代谢产物（色素、固醇、生物碱、植物杀虫剂等）为目的的大规模细胞培养技术。,发展历史,1902年，德国植物学家Haberlandt根据细胞学说，提出单个细胞的植物细胞全能性理论。并首次尝试分离植物组织并培养叶片细胞，但未成功。他被称为“植物组织培养之父”。1904年，Hanning最先成功地培养了萝卜和辣根菜的胚。1922年，Knudson采用胚培养法获得大量兰花幼苗。,1934年，White用番茄根尖建立起第一个活跃生长的无性繁殖系，从而使非胚器官的培养首先获得成功。1948年，斯科克发现腺嘌呤生长素的比例是控制芽和根形成的重要条件。1954年，Skoog发现一种叫激动素的细胞分裂素它与生长素的比例可控制器官分化。1958年，英国科学家Steward等用胡萝卜根的愈伤组织细胞进行悬浮培养，成功诱导出胚状体并分化为完整的小植株，不但使细胞全能性理论得到证实，而且为组织培养的技术程序奠定了基础。,1962年，Murashinge和Skoog在烟草培养中筛选出至今仍被广泛使用的MS培养基。1964-1966年，印度科学家Guha和Maheswari在曼陀罗花药培养中首次由花粉诱导得到了单倍体植株。1972年，Carlson通过两个种的烟草原生质体融合培养，获得了第一个体细胞杂交的杂种植株。,20世纪60年代，植物组织培养开始大规模应用。1960年，莫雷尔用兰属的茎尖培养，实现了去病毒和快速繁殖。这一技术导致欧美“兰花工业”的兴起。20世纪中期，美国应用组培技术获得的芹菜苗已经成功地取代了种子繁殖的传统方法。我国目前在番茄、辣椒、马铃薯、人参、花卉、果品生产中广泛投入应用。组织培养技术被誉为农业发展史上第四次绿色革命。,植物组织培养的理论基础,无性繁殖（asexualreproduction）不经生殖细胞结合的受精过程，由母体的一部分直接产生子代的繁殖方法。后代与亲代在遗传性上完全一致。林业上常用树木营养器官的一部分和花芽、花药、雌配子体等材料进行无性繁殖。花药、花芽、雌配子体常用组织培养法离体繁殖。生根后的植物与母株的基因是完全相同的。,无性繁殖的意义：有性繁殖：是用种子进行播种繁殖，故又称种子繁殖。优点：是繁殖数量大，根系完整，生长健壮。缺点：是一些通过异花授粉的花卉容易发生变异，不易保持原品种的优良特征。,无性繁殖：是利用母体营养器官的一部分作为繁殖材料，进行分生、扦插、压条、嫁接繁殖和组织培养快速繁殖及植物的无融合生殖等，使之形成一个新的个体，所以又称营养繁殖。优点：是能保持品种的优良特性、生长快、短期内获得大量后代。缺点：是繁殖方法不如有性繁殖简便。,植物细胞的全能性,植物细胞全能性：植物细胞具有该植物体全部遗传的可能性，在一定条件下具有发育成完整植物体的潜在能力。是植物细胞工程的理论基础。实验表明，处于离体状态的植物活细胞，在一定的营养物质、激素和其他外界条件的作用下，就可能表现出全能性，发育成完整的植株。人工条件下实现的这一过程，就是植物组织培养。,植物细胞全能性表现根据细胞类型不同从强到弱:营养生长中心形成层薄壁细胞特化细胞(筛管、导管细胞)厚壁细胞(木质化细胞)；根据细胞所处的组织不同从强到弱为：顶端分生组织居间分生组织侧生分生组织薄壁组织(基本组织)厚角组织输导组织厚壁组织。,植物细胞全能性的表达,脱分化（dedifferentiation)：分化的细胞在一定条件下，转变为胚性状态，重新获得分裂能力。愈伤组织：脱分化细胞经过细胞分裂，产生无组织结构、无明显极性、松散的细胞团。细胞由静止状态被诱导激活，蛋白质合成旺盛，RNA含量迅速增加。细胞进入分裂期，形成愈伤组织。愈伤组织的诱导是植物细胞体外再生的第一步。,愈伤组织的种类1、胚性愈伤组织：表面光滑、组织结构紧凑、细胞小、再生力强。在适宜的培养条件下能分化出再生植株的离体培养物。胚性愈伤组织容易形成胚状体。2、非胚性愈伤组织：表面粗糙、组织结构疏松、细胞大，呈淡黄色。不具备产生再生植株潜力的离体培养物。,注意：并不是所有的细胞脱分化的结果都必然形成愈伤组织。有些植物体的细胞脱分化以后直接形成胚性细胞，进而形成体细胞胚。愈伤组织内的细胞并不都是未分化的细胞，即同一愈伤组织内的细胞的分化状态存在一定的差异。,细胞和组织分化与脱分化的区别,再分化（redifferentiation):经脱分化的组织或细胞在一定的培养条件下，重新分化为各种类型细胞，并进一步发育为完整植株。愈伤组织再分化的2个途径：器官发生：将愈伤组织先后置于两种培养基上，分别诱导形成芽和根。胚状体发生：愈伤组织形成类似种子的胚的结构，产生芽端结构与根端结构，成为胚状体。再进一步发育为成熟胚。,胚状体分为：体细胞胚：来源于植物二倍体细胞（根、茎、叶），发育为正常可育植株。生殖细胞胚：来源于单倍体大、小孢子细胞，发育为单倍体植株。染色体加倍后可育。,再分化期的细胞酶活性增强，RNA和组蛋白合成速度加快，营养物质积累。再分化期细胞的形态大小保持相对稳定，细胞由平周分裂转变为组织内部局部分裂，形成“瘤状”或“片状”分生组织。,甘蓝,辣椒,草莓,离体的植物器官、组织、细胞,脱分化,愈伤组织,再分化,根芽,植物体,植物组织培养过程,植物组织培养条件：,含有全部营养成分的培养基、一定的温度、空气、无菌环境、适合的PH、适时光照等。,影响细胞脱分化与再分化的因素,激素：生长素能促进维管组织形成细胞分裂素与木质部的发生有关激素可能是通过在转录或翻译水平上的调节作用而影响相关基因的表达，从而调控细胞分化。在植物中细胞种类的不同或同一种细胞不同的发育状态，均会影响该种细胞对激素的反应，所以很难寻找到不同激素在分化中作用的共同模式。,蔗糖浓度,光照与温度光照对于维管组织的分化具有促进作用，适宜的温度对于维管组织的分化是必需的。,植物组织培养特点,培养条件可以人为控制组织培养采用的植物材料完全是在人为提供的培养基质和小气候环境条件下进行生长，摆脱了大自然中四季、昼夜的变化以及灾害性气候的不利影响，且条件均一，对植物生长极为有利，便于稳定地进行培养生产。,生长周期短，繁殖率高植物组织培养是由于人为控制培养条件，根据不同植物不同部位的不同要求而提供不同的培养条件，因此生长较快。另外，植株也比较小，往往2030d为一个周期。所以，虽然植物组织培养需要一定设备及能源消耗，但由于植物材料能按几何级数繁殖生产，故总体来说成本低廉，且能及时提供规格一致的优质种苗或脱病毒种苗。,管理方便，利于工厂化生产和自动化控制植物组织培养是在一定的场所和环境下，人为提供一定的温度、光照、湿度、营养、激素等条件，既利于高度集约化和高密度工厂化生产，也利于自动化控制生产。它是未来农业工厂化育苗的发展方向。它与盆栽、田间栽培等相比省去了中耕除草、浇水施肥、防治病虫害等一系列繁杂劳动，可以大大节省人力、物力及田间种植所需要的土地。,植物组织培养,营养条件培养基(culturemedium)是植物组织培养的重要基质。在离体培养条件下，不同种植物的组织对营养有不同的要求，甚至同一种植物不同部位的组织对营养的要求也不相同。因此，没有一种培养基能够适合所有类型的植物组织或器官，在建立一项新的培养系统时，首先必须找到合适的培养基，培养才有可能成功。,培养基的种类,培养基有许多种类，根据不同的植物和培养部位及不同的培养目的需选用不同的培养基。Sacks(1680)和Knop(1681)，对绿色植物的成分进行了分析研究，根据植物从土中主要是吸收无机盐营养，设计出了由无机盐组成的Sacks和Knop溶液，至今仍在作为基本的无机盐培养基得到广泛应用。White培养基在40年代用得较多，现在还常用。60和70年代则大多采用MS等高浓度培养基，可以保证培养材料对营养的需要，并能生长快、分化快。,目前，常用的培养基及特点如下：(1)MS培养基1962年，由Murashige和Skoog为培养烟草细胞而设计的。特点：无机盐和离子浓度较高，是较稳定的平衡溶液。由于浓度高，在配制中某些成分有些出入，也不致影响培养基的离子平衡。硝酸盐含量较其他培养基高。养分的数量和比例较合适，可满足植物的营养和生理需要。广泛地用于植物的器官、花药、细胞和原生质体培养，效果良好。,(2)B5培养基是1968年由Galmborg等为培养大豆根细胞而设计的。其主要特点是含有较低的铵，对不少培养物的生长有抑制作用。双子叶植物，特别是木本植物在B5培养基上生长更适宜。(3)White培养基是1943年由White为培养番茄根尖而设计的。1963年又作了改良，称作White改良培养基，提高了MnSO4的浓度和增加了硼酸。其特点是无机盐数量较低，适于生根培养。,（4）N6培养基是1974年朱至清等为水稻等禾谷类作物花药培养而设计的。其特点是成分较简单，KNO3和（NH4）2SO4含量高。在国内已广泛应用于小麦、水稻及其他植物的花药培养和其他组织培养。(5)KM8P培养基它是1974年为原生质体培养而设计的。其特点是有机成分较复杂，它包括了所有的单糖和维生素，广泛用于原生质融合的培养。,培养基的组成：培养基的成分主要可以分水、无机盐、有机物、天然复合物、培养体的支持材料等五大类。,水是植物原生质体的组成成分，也是一切代谢过程的介质。它是生命活动过程中不可缺少的物质。配制培养基母液时要用蒸馏水，以保持母液及培养基成分的精确性，防止贮藏过程发霉变质。大规模生产时可用自来水。但在少量研究上尽量用蒸馏水，以防成分的变化引起不良效果。,无机元素,大量元素：指浓度大于0.5mmolL的元素等。(1)N是蛋白质、酶、叶绿素、维生素、核酸、磷脂、生物碱等的组成成分，是生命不可缺少的物质。在制备培养基时以NO3N和NH4N两种形式供应。大多数培养基既含有N03N又含NH4N。NH4N对植物生长较为有利。供应的物质有KNO3、NH4NO3等。,(2)P是磷脂的主要成分。而磷脂又是原生质、细胞核的重要组成部分。磷也是ATP、ADP等的组成成分。在植物组织培养过程中，向培养基内添加磷，不仅增加养分、提供能量，而且也促进对N的吸收，增加蛋白质在植物体中的积累。常用的物质有KH2P04或NaH2P04等。,(3)K对碳水化合物合成、转移、以及氮素代谢等有密切关系。K增加时，蛋白质合成增加，维管束、纤维组织发达，对胚的分化有促进作用。但浓度不易过大，一般为13mgL为好。制备培养基时，常以KCL、KN03等盐类提供。,(4)Mg、S和Ca:Mg是叶绿素的组成成分，又是激酶的活化剂；S是含S氨基酸和蛋白质的组成成分。Mg、S常以MgSO47H20提供。用量为13mgL较为适宜；Ca是构成细胞壁的一种成分，Ca对细胞分裂、保护质膜不受破坏有显著作用，常以CaCl22H2O提供。,微量元素：指小于0.5mmolL的元素，Fe，B，Mn，Cu，Mo，Co等。铁是一些氧化酶、细胞色素氧化酶、过氧化氢酶等的组成成分。同时，它又是叶绿素形成的必要条件。培养基中的铁对胚的形成、芽的分化和幼苗转绿有促进作用。在制做培养基时，用Fe7H20和Na2EDTA结合成螯合物使用。B，Mn，Zn，Cu，Mo，Co等，也是植物组织培养中不可缺少的元素，缺少这些物质会导致生长、发育异常现象。,有机化合物,培养基中若只含有大量元素与微量元素，常称为基本培养基（basicmedium)。由于不同的培养目的，往往要加入一些有机物以利于快速生长。常加入的有机成分主要有以下几类：,碳水化合物最常用的碳源是蔗糖，葡萄糖和果糖也是较好的碳源，可支持许多组织很好的生长。蔗糖使用浓度在2%3%，常用3%，但在胚培养时采用4%-15%的高浓度，因蔗糖对胚状体的发育起重要作用。不同糖类对生长的影响不同。从水稻根的培养来看，以葡萄糖效果最好，果糖和蔗糖相当，麦芽糖差一些。高压灭菌时，一部分糖会发生分解，制定配方时要给予考虑。,维生素(vitamin)在植物细胞里主要是以各种辅酶的形式参与多种代谢活动，对生长、分化等有很好的促进作用。植物细胞在培养中通常需加入一至数种维生素。主要有VBl(盐酸硫胺素)、VB6(盐酸吡哆醇)、Vpp(烟酸)、Vc（抗坏血酸），有时还使用生物素、叶酸、VB12等。一般用量为0.11.0mgL。VB1对愈伤组织的产生和生活力有重要作用，VB6能促进根的生长，Vpp与植物代谢和胚的发育有一定关系。,肌醇:又叫环己六醇，在糖类的相互转化中起重要作用。通常可由磷酸葡萄糖转化而成，还可进一步生成果胶物质，用于构建细胞壁。肌醇与6分子磷酸残基相结合形成植酸，植酸可进一步形成磷脂，参与细胞膜的构建。使用浓度一般为lOOmgL，适当使用肌醇，能促进愈伤组织的生长以及胚状体和芽的形成。对组织和细胞的繁殖、分化有促进作用。,氨基酸是很好的有机氮源，可直接被细胞吸收利用。培养基中最常用的氨基酸是甘氨酸，其他的如精氨酸、谷氨酸，谷酰胺、天冬氨酸、天冬酰胺、丙氨酸等也常用。有时应用水解乳蛋白或水解酪蛋白。,天然复合物,其成分比较复杂，大多含氨基酸、激素、酶等一些复杂化合物。它对细胞和组织的增殖与分化有明显的促进作用，但对器官的分化作用不明显。它的成分大多不清楚，所以一般应尽量避免使用。,1)椰乳是椰子的液体胚乳。它是使用最多、效果最大的一种天然复合物。一般使用浓度在10%20%。它在愈伤组织和细胞培养中有促进作用。在马铃薯茎尖分生组织和草莓茎尖培养中起明显的促进作用。2)香蕉用黄熟的小香蕉，加入培养基后变为紫色。对pH值的缓冲作用大。主要在兰花的组织培养中应用，对发育有促进作用。,3)马铃薯去掉皮和芽后，加水煮30min，再经过过滤，取其滤液使用。对pH值缓冲作用也大。添加后可得到健壮的植株。4)水解酪蛋白为蛋白质的水解物，主要成分为氨基酸。受酸和酶的作用易分解，使用时要注意。5)其他酵母提取液(YE)，主要成分为氨基酸和维生素类；麦芽提取液、苹果和番茄的果汁、黄瓜的果实、未熟玉米的胚乳等。遇热较稳定，大多在培养困难时使用，有时有效。,植物生长调节物,植物激素是植物新陈代谢中产生的天然化合物，它能以极微小的量影响到植物的细胞分化、分裂、发育，影响到植物的形态建成、开花、结实、成熟、脱落、衰老和休眠以及萌发等许许多多的生理生化活动，在培养基的各成分中，植物生长调节物是培养基的关键物质，对植物组织培养起着决定性作用。,生长素类(auxin)生长素主要被用于诱导愈伤组织形成，诱导根的分化和促进细胞伸长生长。在促进生长方面，根对生长素最敏感。在极低的浓度下，就可促进根的生长，其次是茎和芽。组织培养中常用人工合成的生长素类物质。IAA(吲哚乙酸)是天然存在的生长素，亦可人工合成，其活力较低，是生长素中活力最弱的激素，对器官形成的副作用小，高温高压易被破坏，也易被细胞中的IAA分解酶降解，受光也易分解。,NAA(萘乙酸)在组织培养中的作用比IAA高出3-4倍，且由于可大批量人工合成，耐高温高压，不易被分解破坏，所以应用较普遍。NAA广泛用于生根，并与细胞分裂素互作促进芽的增殖和生长。IBA(吲哚丁酸)是促进发根能力较强的生长调节物质。2，4D(2，4二氯苯氧乙酸)作用比IAA高10倍，特别在促进愈伤组织的形成上活力最高，但它强烈抑制芽的形成，影响器官的发育。适宜的用量范围较狭窄，过量常有毒效应。,细胞分裂素类(cytokinin)这类激素是腺嘌吟的衍生物，包括6BA(6苄基氨基嘌呤)、Kt(kinetin激动素)、Zt(zeatin玉米素)等。其中Zt活性最强，但非常昂贵，常用的是6BA。在培养基中添加细胞分裂素有三个作用：诱导芽的分化促进侧芽萌发生长。促进细胞分裂。抑制根的分化。因此，多用于诱导不定芽的分化和茎、苗的增殖，而在生根培养时使用较少。,赤霉素类(gibberellicacid，GA)有20多种，培养基中添加的是GA3，主要用于促进幼苗茎的伸长生长，促进不定胚发育成小植株；赤霉素和生长素协同作用，对形成层的分化有影响，当生长素赤霉素比值高时，有利于木质部分化；比值低时，有利于韧皮部分化；赤霉素还用于打破休眠，促进种子、块茎、鳞茎等提前萌发。一般在器官形成后，添加赤霉素可促进器官或胚状体的生长。,激素配比模式,生长素与细胞分裂素的比例决定着发育的方向。如为了促进芽器官的分化，应降低生长素的浓度，或调整培养基中生长素与细胞分裂素的比例。高有利于根的形成和愈伤组织的形成生长素/分裂素适中有利于根、芽的分化低有利于芽的形成,在组织培养中生长调节物质的使用浓度，因植物的种类、部位、时期、内源激素等的不同而异，一般生长素浓度的使用为0.05-5mgL，细胞分裂素0.0510mgL。,Growthmediumisoptimisedforregenerationofplantlets,Nosucrose(0%),Sucrosereducedto1%,Sucroseincreasedto5%,Theexplantiscompletelycoveredwithgreenshoots,androotsaredevelopingonthelowersurface,Veryfewshootshavedevelopedontheexplant.Norootsandnocallus.,Shootsdevelopedonedgesofuppersurface,andsomerootdevelopmenthasoccured,Shootshavedevelopedoverthesurfaceoftheexplant,alongwithrootsfromthelowersurface.Theresultiscomparablewiththecontrolmedium,tissuecultureintheAfricanViolet,NoBAP,BAPreducedto0.1mg.l-1,NoNAA,Poorshootdevelopmentandnoroots.Extensivecallusgeneration,Poorshootdevelopmentandnoroots,NAAreducedto0.1mg.l-1,Morebalanceddevelopmentofrootsandshoots.However,undifferentiatedcallusisdevelopingattheedgesoftheexplant,Profusedevelopmentofrootsandareducednumberofshoots.Undifferentiatedcallusisdevelopingattheedgesoftheexplant,NAAincreasedto5.0mg.l-1Profusedevelopmentofrootsovertheexplantupperandlowersurface,andfewshoots.Somecallus,NoMSsaltsNosignofregenerationfromexplantatall.,MSsaltsreducedto0.47g.l-1Somerootgrowthbutreduceddevelopmentofshoots,MSsaltsincreasedto9.52g.l-1Shootsdevelopedonuppersurfaceofexplant.Norootsorcallus.,培养材料的支持物,琼脂(agar)是由海藻中提取的一种高分子碳水化合物，本身不提供营养,但却是最好的固化剂。能溶解在热水中，成为溶胶，冷却至40凝固为固体状凝胶。用量在610g/L之间。若浓度太高，培养基会变硬，营养物质难以扩散到组织中;若浓度过低，凝固性不好。凝固能力与高压灭菌的温度、时间、pH值等有关，长时间的高温会使凝固能力下降，过酸过碱加之高温会使琼脂发生水解。时间过久，琼脂也会丧失凝固能力。,优点:操作简便，通气问题易于解决，便于观察。缺点：培养物与培养基的接触面积小，各种养分在琼脂中扩散较慢，影响养分的充分利用；同时排出的一些代谢废物，聚集在吸收表面，对组织产生毒害作用。市售的琼脂几乎都含有杂质，因此，在研究植物组织或细胞的营养问题时，则应避免使用琼脂。其他有玻璃纤维、滤纸桥、海绵、脱脂棉、卡拉胶等，总的要求是排出的有害物质对培养材料没有影响或影响较小。,抗生物质,抗生物质有青霉素、链霉素、庆大霉素等，用量在520mg/L之间。添加抗生物质可防止菌类污染，减少培养中材料的损失，尤其是快速繁殖中。对于刚感染的组织材料，可向培养基中注入5%10%的抗菌素。可两种抗生素混用。但是抗生素对植物组织的生长也有抑制作用。,活性炭,活性炭为木炭粉碎加工形成的粉沫结构，它结构疏松，孔隙大，吸水力强，有很强的吸附作用。颗粒大小决定着吸附能力、粒度越小，吸附能力越大。温度低吸附力强，温度高吸附力减弱，甚至解吸附。通常使用浓度为0.5l0gL。它可以吸附非极性物质和色素等大分子物质，包括琼脂中所含的杂质，培养物分泌的酚、醌类物质等。,活性炭的应用,茎尖初代培养，加入适量活性炭，可以吸附外植体产生的致死性褐化物；活性炭可明显促进新梢的形成和伸长，但其作用一般为0.1%0.2%，不能超过0.2%。活性炭在生根时有明显的促进作用，其机理一般认为活性炭通过减弱光照保护了IAA，从而间接促进了根的生长，由于根的生长加快，吸收能力增强，反过来又促进茎、叶的生长。,活性炭在胚胎培养中也有一定作用，如在葡萄胚珠培养时向培养基加入0.1%的活性炭，可减少组织变褐和培养基变色，产生较少的愈伤组织。活性炭具有副作用，极少量的活性炭可以完全吸附培养基中的调节物质。大量的活性炭加入会削弱琼脂的凝固能力。因此，在使用时要有量的意识，使活性炭发挥其积极作用。,培养基的选择,由一种已被广泛使用的基本培养基(如Ms培养基或B5培养基)开始。对这种培养基做了某些定性和定量的小变动之后，即有可能得到一种能满足实验需要的新培养基，选择最佳培养基。常用试验方法主要有单因子试验、多因子试验及广谱实验等。,单因子试验,单因子试验：培养基中其他成分都维持在一般水平上，只变动一个因子，可以找出这一因子对试验的影响和影响的程度。例如：Ms基本培养基的其他成分和用量都不变，只变动NAA用量,观察对某一培养物生根的影响，这种只研究一个因素的试验就是单因子试验。,必需设置对照组与试验组，试验组可以有一组或几组，对照组也可能有一组以上。对照组与试验组中的试验个体，必须在遗传性、生理状态、前培养条件等方面，尽可能完全一致。试验中各处理都要设有一定的重复，随试验规模和要求不同，大多每个项目要有410瓶，每瓶至少3块培养物或3丛小幼苗。,2种激素5种浓度的实验组合,对培养基中两个或两个以上因素进行研究的试验称为多因子实验，各个因子的每个水平相互搭配，构成了所有可能的处理组合，如研究NAA和6BA的最佳浓度组合，每个因子各设5个浓度水平(0，0.5，2.5，5，10mgL)，这两种因子各种浓度的所有组合，就构成了一个具有25项处理的试验。,多因子试验,广谱实验法,广谱实验法中，把培养基中所有组分分为4大类：无机盐、有机营养物质(蔗糖、氨基酸和肌醇等)、生长素、细胞分裂素。对每一类物质选定低(L)、中(M)、和高(H)3个浓度。4类物质各3种浓度的自由组合即构成了一项包括81个处理的实验。81个处理中，最好的一个可用4个字母表示。例如，一个包含中等浓度无机盐，低等浓度生长素、中等浓度细胞分裂素和高等浓度有机营养物质的处理即可表示为MLMH。再试用不同类型的生长素和细胞分裂素，即可找到最佳配方。,培养基的制备,母液的配制和保存为简便起见，通常先配制一系列母液，即贮备液。所谓母液是欲配制液的浓缩液，一般母液配成比所需浓度高10-100倍。母液配制时可分别配成大量元素、微量元素、铁盐、有机物和激素类等。配制时注意一些离子之间易发生沉淀，如Ca2+和S042，Ca2+、Mg2+和PO43-一起溶解后，会产生沉淀，一定要充分溶解再放入母液中。,配制母液时要用蒸馏水或重蒸馏水。药品应选取等级较高的化学纯或分析纯。各种药品先以少量水让其充分溶解，然后依次混合。一般配成大量元素、微量元素、铁盐、维生素等母液，其中维生素、氨基酸类可以分别配制，也可以混在一起。母液配好后放人冰箱内低温保存，用时再按比例稀释。,母液的配制方法：单配法：将培养基配方中的各种成分分别配成一定浓度的母液。一般用a:b表示，即每b毫升溶液中含有a毫克溶质。混配法：将几类营养成分按配方中的用量扩大一定倍数称量，分别溶解后，每一类混合在一起，定容到一定体积，配成混合母液。,应将各种成分记在纸上，配制培养液时，加进一个，划掉一个，确保准确。在装有培养基的各类玻璃器皿上写上标记。,培养基的灭菌,方法：高压蒸汽灭菌：固体培养基过滤灭菌法：液体培养基高压蒸汽灭菌：灭菌锅要留有一定空间，便于蒸汽回流。保压时间要严格，过长会破坏培养基中的化学物质。在101.3kPa消毒1540min.,植物材料的清洗和灭菌,从外界或室内选取的植物材料，都不同程度地带有各种微生物，会造成培养基污染。因此，植物材料必须经严格的表面灭菌处理。,第一步：清洗。除去材料不用部分，将需要的部分仔细洗干净，可用适当的刷子刷洗。把材料切割成适当大小，流水冲洗，冲洗时间视材料清洁程度而异。易漂浮或细小的材料，可装入纱布袋内冲洗。可加入洗衣粉清洗，然后再用自来水冲净洗衣粉水。洗衣粉可除去轻度附着在植物表面的污物，除去脂质性的物质，便于灭菌液的直接接触。最理想的清洗物质是表面活性物质吐温。,第二步：对材料表面浸润灭菌在超净台或接种箱内完成，用70%酒精浸1030s。酒精具有使植物材料表面被浸湿的作用，但其穿透力强，易杀伤植物细胞，所以浸润时间不能过长。有一些特殊的材料，如果实、花蕾等，以及主要取用内部的材料，则可只用70%酒精处理稍长的时间。,第三步：用灭菌剂处理表面灭菌剂的种类较多，可根据情况选取12种使用。,常用灭菌剂使用浓度及效果比较表,灭菌剂应现配现用，氯化汞可短期内贮用。次氯酸钠和次氯酸钙都是利用分解产生氯气来杀菌的，故灭菌时用广口瓶加盖较好；升汞是由重金属汞离子来达到灭菌的；但难以去除升汞残毒，应当用无菌水涮洗810次，每次不少于3min，尽量去除残毒。过氧化氢是分解释放原子态氧来杀菌的，这种药剂残留的影响较小，灭菌后用无菌水涮洗34次即可,在灭菌液中加吐温80（Tween80）效果较好，主要作用是使药剂更易于展布，更易浸入到灭菌材料表面。应注意吐温的用量和灭菌时间，一般加入灭菌液的O.5%。,最后一步：是用无菌水涮洗无菌水涮洗作用是免除消毒剂杀伤植物细胞的副作用。涮洗要每次3min左右，视采用的消毒液种类，涮洗3-l0次左右。,接种,(1)在超净台上，将灭菌后的材料放置在灭过菌的4层纱布上或滤纸上干燥。(2)吸干后，对材料进行适当的切割。如叶片切成0.5cm见方的小块；茎切成含有一个节的小段。微茎尖要剥成只含l2片幼叶的茎尖大小等。在接种过程中要经常灼烧接种器械，防止交叉污染。,(3)将切割好的外植体插植或放置到培养基上。材料放置方法除茎尖、茎段要正放(尖端向上)外，其他尚无统一要求。放置材料数量倾向少放，每次接种以一支试管放一枚组块为宜。,种质保存,概念：种质：是决定生物遗传性状，并将遗传信息从亲代传递给子代的遗传物质。,种质保存的方法按保存的地理位置分为原地保存和异地保存。原地保存是在原有的生态环境条件下,就地保存,自我繁殖品种资源。野生品种资源采用这种方式保存,如建立自然保护区、天然公园等。异地保存是将种子或植株保存于原产地以外的地区,这种保存可采用植物园、种质园、种质库等形式或采用试管保存形式。,按照保存的具体方法,品种资源的保存可分为：种植保存贮藏保存试管保存基因文库保存,1、种植保存品种资源材料每隔一定时间播种一次,即种植保存。种植条件尽可能与原产地相似,尽可能避免或减少天然杂交和人为混杂。尽可能地保持原品种的遗传特点和群体结构。,2贮藏保存贮藏保存就是用控制贮藏条件(主要是温度和湿度)的方法,来保持品种资源种子的生活力。长期贮藏保存种子生活力的技术关键是低温和干燥,通过控制种子周围环境中的温度和湿度,迫使种子处于代谢作用的最低限度。,3、基因文库保存利用DNA重组技术，将种质材料的总DNA或染色体所有片断随机连接到载体上，然后转移到寄主细胞中，通过细胞增殖，构成各个DNA片断的克隆系。,超低温保存,一、超低温保存的基本原理在液氮中（-196），几乎所有的细胞代谢活动停止，仅保存细胞的活力和形态发生的潜力。当解冻后，能够恢复再生能力。超低温通常指低于一80的低温，保存介质或容器有干冰(一79)、超低温冰箱(-80-150)、液氮(-196)和液氮蒸气相(-140)等，其中液氮最常用。,二、常规超低温保存技术,7、保存材料复苏培养,1、保存材料的选择,2、冷冻前材料预处理,3、添加冷冻防护剂,4、材料冷冻的方法,5、材料保存,6、保存材料解冻,1、保存材料的选择细胞分裂时体积减小，胞内自由水含量下降，细胞抗寒能力会提高，因此在保存前，要加速传代，提高分裂细胞的比例。花粉、茎尖分生组织、芽、种胚、小植株、愈伤组织、体细胞胚等均可以作为保存材料。,2、冷冻前材料预处理加入预冷的保护剂甘露醇或糖（0），可提高组织或细胞渗透压，提高抗寒力，二甲基亚砜（DMSO）、脯氨酸可预防冰晶的形成。预处理方法：将保存材料放在高糖浓度、添加二甲基亚砜（DMSO）、脯氨酸的培养基上，在接近0培养数日。,3、添加冷冻防护剂为了抵抗冻害，使用冷冻防护剂。常用的冷冻防护剂有：二甲基亚砜（DMSO）、甘油、脯氨酸、糖类、乙二醇、乙酰胺、福美氧化硫等。,4、材料冷冻的方法材料冷冻保存的原理：冷冻时，细胞外的溶液水分子，先形成冰晶中心，而冰晶形成的速度与溶液成分、降温速度有关。一般在-20-60范围内，晶体中心增长最快，形成大块冰晶体之后，慢慢减速，到-140时完全停止增长。,important,冷冻处理方法,快速冷冻法,慢速冷冻法,预冷冻法,干燥冷冻法,快速冷冻法：将植物材料从0或其它的预处理温度直接投入液氮中保存的方法。植物体内水分从-20-140范围内是冰晶形成和增长的危险温度区，到-140时完全停止增长。快速冷冻法关键是利用高速降温越过冰晶增长的危险温度区，这样就不能形成致死的冰晶。,降温速率为1000/min,慢速降温法：将植物材料从0或其它的预处理温度以1-2/min降到-100，稳定1h后再投入液氮中保存。缓慢冷冻，细胞内的自由水扩散到细胞外的冰晶表面，并形成冰，使细胞发生保护性的脱水，避免在细胞内形成冰晶，这样细胞可以存活。,预冷冻法：投入液氮前，需要经过短暂时间的低温锻炼。两步冷冻：慢速冷冻至-40，停留一段时间，快速冷冻。逐级冷冻：材料通过不同温度等级降温至-40，停留一段时间，投入液氮快速冷冻。,干燥冷冻：将材料置于27-29的烘箱内降低植物含水量，再投入液氮中保存的方法。该方法可以防止植物冻死。,5、材料保存-196液氮中保存。6、保存材料解冻解冻速度是解冻技术关键，一般在37的热水浴中解冻。解冻速度慢，细胞内容易发生再结晶，而导致细胞死亡。解冻速度快，来不及再结晶，细胞存活。,7、保存材料复苏培养保存材料解冻后，需用液体培养基冲洗几遍，除去冷冻防护剂的残留毒害。然后可以在固体培养基上进行培养，正常生长，再生植株。,一般为愈伤组织、悬浮细胞、胚、花粉和茎尖,超低温保存的意义,能保持细胞培养物的稳定性细胞在超低温保存条件下，可保持遗传性状的不变。可保存无病毒原种、实验材料、防止再培养中遗传变异。长期保存植物的种质资源对稀有、珍贵的濒危植物，可建立长期保存的人工种质库。长期保存农作物的优良品种及育种亲本材料的种质,细胞培养,植物细胞培养（plantcellculture）：是指在离体条件下对植物单个细胞或小的细胞团进行培养使其增殖的技术。根据培养规模:小规模培养和大批量培养；根据培养方式:悬浮培养、单细胞培养等；根据要求产物:用于诱变的细胞培养和生产次生产物的细胞培养。,单细胞分离,由完整的植物器官分离单细胞叶片是分离单细胞的最好材料机械法：只有薄壁组织排列松散，细胞间结触点很少时，用机械法分离叶肉细胞才能取得成功。酶解法：果胶酶由培养组织中分离单细胞,细胞悬浮培养,是将单个游离细胞或小细胞团悬浮在液体培养基中进行培养增殖的技术。1、细胞可以不断增殖，形成高密度的细胞群体，适于大规模培养；2、能够提供大量较为均匀的细胞，为研究细胞的生长、分化创造方法和条件。,悬浮细胞培养体系必须满足三个条件：,悬浮培养物分散性良好，细胞团较小，一般在3050个细胞以下，在实际培养中很少有完全由单细胞组成的植物细胞悬浮系。均一性好，细胞形状和细胞团大小大致相同。悬浮系外观为大小均一的小颗粒，培养基清澈透亮，细胞色泽呈鲜艳的乳白或淡黄色。细胞生长迅速，悬浮细胞的生长量一般23天甚至更短时间便可增加一倍。,单细胞培养技术,植物单细胞培养的意义1、建立单细胞无性系悬浮培养细胞间在遗传、生理和生化上存在差异，这些差异反映在它们的产量、品质、抗病虫性和抗逆性等方面。如果能将高抗、高产、高品质的细胞株筛选出来，无疑会带来巨大的经济效益。2、排除体细胞的干扰3、利于对细胞活动跟踪观察,单细胞培养的方法,1、细胞平板培养概念：将制备好的单细胞悬浮液，按照一定的细胞密度，接种在1mm左右的薄层固体培养基上进行培养，称之为平板培养主要技术要点：单细胞的分离：一般采用酶分离法，小细胞团不能超过6个细胞，因此过滤时网筛的网眼要选择合适。单细胞悬浮液的制备：分离的单细胞经培养基洗涤2次以后，调整密度为5105/ml,植板：将1份已调整好密度的单细胞悬浮液与4份35的固体培养基充分混合均匀，然后均匀的平铺与培养皿中，其厚度为1-2mm。待植板后的培养基完全凝固后，用石蜡或parafilm封口膜将培养皿封严以防污染在25黑暗条件下培养3周即可长出肉眼可见的愈伤组织。,2、看护培养概念：用一块愈伤组织或植物离体组织看护单细胞使其生长增殖的一种单细胞培养方法。,3、微室培养概念：人工制造一个小室，将单细胞培养在小室中的少量培养基上，使其分裂增殖形成细胞团的方法，称微室培养。特点：（1）能在显微镜下追踪单细胞分裂增殖形成细胞团的全过程（2）培养基少，营养和水分难以保持，pH值变动幅度大，培养细胞仅能短期分裂。,植物细胞大规模培养与次生代谢产物生产,一.概述二.培养系统三.植物细胞规模培养技术要点技术要点四.提高细胞次生代谢产物的途径五.细胞规模化培养中的有关技术问题,IntroductionPrimarymetabolitesarecompoundsneededinthebasicprocessesthatkeeptheplantalive,suchascarbohydrates,proteinsandlipids.Secondarymetabolitesarecompoundsproducedinplantsthatarenotnecessaryfortheplantsbasicfunctions.Somesecondarymetabolitesareproducedaschemicaldefenseagainstmicrobesandanimals.,Type:Secondarymetabolitesareusedinthepharmaceuticalindustry,asflavourantsanddyes,andinperfumery.Secondarymetabolitesincludeterpenes,cardiacglycosides,steroidalcompounds,alkaloidsandmanymore.,2植物次生代谢产物在医药、食品、轻化工业等领域具有重要意义。李时珍（1593）在本草纲目中所开列的1892种药物绝大多数是植物药物，目前仍有约25的法定药品来自植物。其药物的有效成分均为次生产物。,许多植物次生代谢产物是优良的食品添加剂和名贵化妆品原料。有些是生物毒素的主要来源，可以用于杀虫、杀菌，而对环境和人畜无害，是理想的环保产品。例如：从胡萝卜、万寿菊提取色素从黄菊提取芳香油栀子提取果酸：果酸含有大量的维生素，如维生素C、柠檬酸等。主要用作食品的调味剂，化妆行业用于制作护肤品和洗发香波等，美容院用作换肤液。,3规模化细胞培养是生产植物次生产物的理想途径保护生态环境提高生产效率发展新型生物技术产业,培养系统,1.悬浮培养系统机械搅拌式培养系统机械搅拌式生物反应器通常是根据植物细胞的特性在微生物发酵罐的基础上作如下改进：搅拌装置要减少剪切，一般改叶轮式为螺旋式因为植物细胞生长周期长，需要随时补充水分和营养，因此必须设计加液装置；由于植物细胞的生理活动需要新鲜空气，且细胞代谢也可能产生有害气体，所以必须设计通气装置；为便于取样观察，一般还设计有取样口。,气压搅拌式培养系统考虑到机械搅拌式反应器的剪切作用难以避免，同时搅拌器转动的中轴往往是容易使培养物污染的部位，因此，发展出空气提升式生物反应器，但其缺点是搅拌不均匀。,2、固定化培养系统,Inmanycallusandsuspensionculturesystems，ithasbeenfoun