次生代谢产物.ppt

植物细胞培养之次生代谢产物生产,植物次生代谢产物的概述研究现状植物细胞大规模培养生产次生代谢产物的基本程序提高次生代谢物生产效率的途径与方法应用实例前景展望,概述,植物次生代谢产物是指植物中一大类并非植物生长发育所必需的小分子有机化合物，其产生和分布通常有种属、器官组织和生长发育期的特异性。次生产物在植物中的合成与分解过程称为次生代谢。,次生代谢过程被认为是植物在长期进化中对生态环境适应的结果，它在处理植物与生态环境的关系中充当着重要的角色。许多植物在受到病原微生物的侵染后，产生并大量积累次生代谢产物，以增强自身的免疫力和抵抗力。植物次生代谢途径是高度分支的途径，这些途径在植物体内或细胞中并不全部开放，而是定位于某一器官、组织、细胞或细胞器中并受到独立的调控。,植物次生产物种类繁多（据保守估计已超过2万种），根据分子结构不同大致分为：,酚类化合物黄酮类单酚类醌类（苯醌、萘醌、蒽醌）萜类化合物三萜皂甙甾体皂甙单萜、倍半萜、二萜含氮化合物生物碱（真生物碱、伪生物碱、原生物碱）胺类（伯、仲、叔、季胺）非蛋白质氨基酸生氰甙多炔类、有机酸等,植物次生代谢产物在医药、食品、轻化工业等领域具有重要意义：,李时珍（1593）在本草纲目中所开列的1892种药物绝大多数是植物药物，目前仍有约25的法定药品来自植物。其药物的有效成分均为次生产物。许多植物次生代谢产物是优良的食品添加剂和名贵化妆品原料。有些是生物毒素的主要来源，可以用于杀虫、杀菌，而对环境和人畜无害，是理想的环保产品。,然而,随着人们对植物资源尤其是药用植物的利用度日益增加，使不少植物资源处于濒危状态。面对着植物有限的蕴藏量，如何进行合理有效地开发利用是我们亟待解决的问题。自从20世纪50年代提出用植物细胞大量培养作为工业化生产植物次生代谢产物的一条途径以来，实践表明，采用植物细胞培养技术生产次生代谢产物是解决资源问题的较为有效的途径。,研究现状,迄今为止，人们已从培养的植物细胞中分离出六百多种次生代谢产物，已使包括紫草、毛地黄、黄连、彩叶紫苏和人参在内的多种植物细胞培养达到工业化生产的规模，并且有的已经生产成商品投入市场。,来自于植物体和细胞培养的紫草宁含量比较,Examplesofenhancementinnaturalproductyieldinselectedcelllinescomparewithparentplantmaterial.(AfterFowler,1983),植物次生代谢产品的市场潜能,规模化细胞培养是生产植物次生产物的理想途径：,保护生态环境提高生产效率发展新型生物技术产业,植物细胞大规模培养生产次生代谢产物的基本程序：,诱导植物产生旺盛生长的愈伤组织和悬浮细胞系筛选高产细胞系在生物反应器中进行大规模培养次生代谢产物的提取、纯化和测定,Stagesinthedevelopmentandoperationofaplantcellbiotechnologyprocess,次生代谢产物的提取、纯化与测定,细胞培养结束后，根据次生代谢产物分布的情况，分别收集细胞和培养液，选用相应的生化分离技术对次生代谢产物进行分离、纯化，并对所得的次生代谢产物的含量进行测定，对其活性进行鉴定。如果次生代谢产物存在于细胞内，则要经过细胞破碎，然后再进行提取和分离纯化。,植物细胞培养进行有效成分的生产发展到现在,已经取得令人瞩目的成就。然而在植物细胞培养过程中普遍存在的细胞系不稳定、细胞生长缓慢、不耐剪切力及代谢物产量低等问题又成为其实现规模化生产的瓶颈。在目前已经研究过的植物中，仅有1/5左右种类的培养物中目的产物的含量接近或超过原植物，多数情况下培养细胞合成某些次生代谢物的能力下降甚至消失。,因此充分利用基因工程的手段，筛选高产细胞系，深入研究特定代谢产物的生物合成途径，对培养条件进行优化，研究和开发适合植物细胞培养的生物反应器是解决这些问题的根本途径。,提高次生代谢产物生产效率的途径和方法：,选择合适的外植体筛选得到高产细胞系（株）寻求合适的培养条件和培养技术,外植体的选择,不同外植体的愈伤组织诱导能力和诱导的愈伤组织合成次级代谢产物能力均不同,所以,在利用植物细胞悬浮培养生产次生代谢产物时,选择能诱导出疏松易碎,生长快速且具有较高次生代谢产物合成能力的愈伤组织的外植体是非常重要的。如在茜草愈伤组织培养过程中,来源于叶柄和茎的愈伤组织蒽醌累积量比来源于茎尖和叶的愈伤组织高。,筛选得到高产细胞系（株）,获得高产株系从选择富含目的产物的植物品种开始，通过其愈伤组织的诱导，异质种群的筛选，即从不同的无性繁殖系中筛选出富含目的产物的品系做种子细胞。,筛选植物高产细胞系常用的方法有目视法、放射免疫法(RIA)、酶联免疫法(ELISA)、高效液相色谱法(HPLC)等。目前国外还采用一种突变种筛选法，其原理是把一些细胞毒性抑制剂如P-氟苯丙氨酸(PFP)、5-甲基色氨酸、草苷磷、维生素H等加入到要筛选的细胞培养体系中，那些耐药性强且经过一段时间培养生长正常的细胞系就可能是所要求的高产细胞系。,合适的培养条件,物理因素：温度：植物细胞培养的最适温度一般为25，但不同的植物种类略有差异，而且植物细胞生长和次生代谢产物的合成所需的温度并不一致，因此选择合理的培养温度并进行相应的调控对于细胞生长以及产物合成十分关键。光照：光强、光质和光照时间对细胞的生长和次生代谢产物的合成都具有一定的影响。不同的光照情况要根据不同的植物细胞来设定。,pH：培养基的pH值与细胞生长繁殖以及次生代谢产物的生产关系密切，与培养温度相似，细胞的生长繁殖与次生代谢产物合成时所需的pH值通常并不一致，需要在不同的阶段控制不同的pH值。电场：膜周电泳学说认为对细胞施加稳定的电场能够导致膜中带电物质的重新分配，最终导致原生质体生长和分化效应。磁场：加速了细胞内的氧化磷酸化过程，从而促进ATP的合成，最终使得有丝分裂指数增高。超声波：有利于细胞次生代谢物向细胞外释放。,化学因素：合理的培养基组分：培养基中的碳源、氮源及其一些微量的金属离子以及一些有机物质不仅是细胞生长以及合成的物质基础，而且很多都能够促进细胞生长或者是有利于产物的形成。一般情况下，增加N、P、K的含量会使细胞的生长加快，增加蔗糖含量可以增加细胞培养物的次生代谢产物的量。还有生长调节物质也是次生代谢产物积累的关键因素。不同种类及不同浓度的生长素和细胞分裂素以及二类激素的不同比例显著的影响着细胞的生长和目的产物的合成。2，4-D，细胞分裂素，KT，GA，脱落酸等。,溶氧：在植物细胞悬浮培养中，溶氧对细胞的生长和代谢有很大的影响，同时，在培养条件中溶氧也是最复杂的因素之一，溶氧有一定的极限，过高或过低都会影响到细胞生长和产物合成，特别是在高密度培养时，供氧不足往往可能是限制产量的主要因素之一，因此溶氧参数的调控对于植物细胞培养十分关键。,前体饲喂：前体是指处于目的代谢物代谢途径上游的物质。植物体内合成代谢处于代谢的众多分支之中，因此前体化合物的供给不足和信号诱导的缺乏会严重影响次生代谢产物的积累。通过前体饲喂细胞，一方面可以通过增加底物量来加快反应速率和提高产率，另一方面还能够反馈抑制分支路径而促进反应顺利进行。然而，许多外源前体的加入有时又会抑制植物细胞的生长，最终影响了次生代谢物的产量，因此就许多前体而言，存在一个前体的最佳添加浓度；类似于前体的最佳添加浓度，前体也有最佳添加时间，当外源前体在这个时间加入，培养物的次生代谢物的产量要高于在其它时间加入时的产量。,诱导子的应用,植物生产次生代谢产物实际是对外界病原体侵袭的一种防御反应，所产生的次生代谢产物统称为植保素。当被类似于病原体的诱导子侵染时植物也会作出相同的反应。诱导子是触发次生代谢物合成的一种信号，为了回应这种外界压力次生代谢途径被启动。,在植物细胞培养中应用的诱导子包括生物诱导子（指来源于生物体的化合物，包括侵染植物的微生物和植物在防御过程中为对抗微生物侵染而产生的物质）外源性诱导子：如病原菌、病菌菌丝体、微生物诱导产生的多糖、蛋白质等。内源性诱导子：来源于植物细胞本身的物质，如降解细胞壁的酶类，细胞壁片段及组分等。目前应用最多的真菌诱导子。如张长平等在红豆杉细胞悬浮培养体系中加入真菌诱导子，结果发现紫杉醇的合成被加强。,非生物诱导子化学伤害胁迫：重金属盐类、去污剂、乙烯、氯仿、杀菌剂等物理伤害胁迫：紫外线、辐射、冻触等,合适的培养方法及技术,两步培养法：根据生长及代谢的需求,调整培养基组分和培养条件,使生长和代谢均能在最适的途经下进行,较好的解决了细胞生物量增长与次生代谢产物积累之间的矛盾,大大提高目的产物的产率。两相培养法：是指在植物细胞培养体系中加入水溶性或脂溶性的有机化合物,或者是具有吸附作用的多聚化合物,使培养体系由于分配系数不同而形成上、下两相,细胞在培养相中生长并合成次生代谢物,这些次生代谢物又通过主动或被动运输的方式释放到胞外,并被吸附相所吸附。,毛状根培养技术：毛状根是双子叶植物各器官受发根土壤杆菌感染后产生的病态组织。感染过程中,发根农杆菌Ti质粒T-DNA转移并整合到植物基因组中。毛状根具有激素自养,增殖速度快,次级代谢产物含量高且稳定等特点。冠瘿培养技术：通过根瘤农杆菌感染植物可以将其Ti质粒的T-DNA片段(含tms基因、tmr基因)整合进入植物细胞的基因组,诱导冠瘿组织的发生。冠瘿组织离体培养时也具有激素自主性、增殖速率较常规细胞培养快等特点,其次生代谢产物合成稳定性与能力较强,用来生产有用次生代谢产物有着良好的开发前景。,反义技术：植物次生代谢是多途径的,是植物体内一系列酶促反应的结果。反义技术是根据碱基互补原理,通过人工合成或者是生物体合成的特定互补的DNA或RNA片段(或者是具化学修饰产物),抑制或封闭某些基因表达的技术。通过此技术,可以将反义DNA或RNA片段导入植物,使催化某一分支代谢中的关键酶的活性受到抑制或增强。这样,目的化合物的含量可以提高,而其它化合物的合成途径则受到抑制。,应用实例,紫杉醇(taxol)是红豆杉科红豆杉属(Taxussp.)植物的树皮、针叶等组织中含有的一种四环、二萜酰胺类化合物,具有独特的抗癌作用,高效、低毒，被称为过去几十年中出现的最好的抗癌药。,但由于紫杉醇在紫杉树的各种组织中的含量都很少,紫杉的生长也非常缓慢,而且紫杉醇的复杂结构和多达12个的手性原子的存在,使合成法几乎不可能具有商业价值。另外，真菌合成的的紫杉醇含量仅有植物细胞的十万分之一,离生产的距离太远。从长远来看,紫杉细胞培养才是解决紫杉醇供需矛盾的最佳途径。因此,紫杉细胞培养的研究近年来十分活跃。,生产过程,愈伤组织诱导及培养（幼茎为外植体，改良B5培养基，15-20天继代）摇瓶液体悬浮培养（温度、接种量、光照、pH、果糖浓度、芳香羟酸和氨基酸、CO2和乙烯、真菌诱导子、合成前体等的加入）紫杉细胞的大规模培养（气动混合生物反应器PMB，非生长偶联两步法培养）,从目前的研究可以看到，有关红豆杉细胞培养生产紫杉醇的进展的确十分喜人,呈现了实际工业化生产的可能性。,前景展望,虽然植物细胞大规模培养生产有用次生代谢产物在过去几十年取得了飞速发展，但真正应用于商业化生产的事例不多，