实验七 植物mRNA原位杂交技术.ppt

实验七植物mRNA原位杂交技术,mRNA原位杂交技术的原理,原位杂交（insituhybridization）是一种在细胞水平上研究基因表达调控的最直接有效的分子生物学技术。RNA原位杂交是用同位素标记或非同位素标记的双链DNA或单链反义RNA探针对组织切片或装片的不同细胞中基因产物mRNA或rRNA进行原位定位。分布于细胞中的mRNA与反义RNA探针互补而杂交产生双链的RNA。标记在反义链上的同位素经放射自显影、非同位素经酶促免疫显色或免疫荧光反应，均可显示mRNA在植物组织细胞中的分布位置。用标记的有义RNA作探针，由于与细胞内的mRNA不互补而不能杂交，可以作为对照。,RNA原位杂交的操作流程,以组织切片和DIG标记RNA探针为例：材料固定与包埋制片质粒DNA线性化和DIG标记的体外转录（探针制备）预杂交杂交杂交后处理免疫反应显色反应封片观察。,一、材料固定和包埋,固定：固定是用固定剂杀死细胞，使细胞的原生质凝固，保持细胞原有的结构。采用的固定剂应穿透力强，能使细胞立刻致死，原生质全部凝固，同时不发生任何变形，增强折光率，并且不妨碍染色和观察。脱水：如果材料含有水分，水与石蜡不能相溶，通常用酒精脱水。材料由水入酒精中，由低浓度酒精渐至高浓度酒精。通常由30%、50%、70%、80%到90%酒精，每次须经半小时左右，具体的时间由材料大小而定。透明：材料脱水后，仍需除去酒精，脱酒精通常用二甲苯。包埋：把材料包埋在石蜡里面，便于切片。,材料固定,简单固定液：1、酒精：常用纯酒精或95%酒精作固定液。酒精穿透力强，固定时间常在1小时以内；70%酒精可作保存液。2、福尔马林：即甲醛，固定用的浓度为4-10%。3、醋酸：又叫冰醋酸。醋酸与水和酒精配成各种比例的溶液，浓度为0.2-5%，也常与其他固定剂配合使用。醋酸穿透性很强，单独使用，有使原生质膨胀的作用，故常与酒精，甲醛等合用，醋酸为固定染色体的优良固定液，因此，固定染色体的固定液中，几乎都含有醋酸,材料固定,混合固定液：1、FAA固定液：植物组织最常用的固定液。固定时间不受限制，并且固定后材料可以正常染色。配方：50%或70%酒精90毫升（软材料用50%酒精，硬材料用70%酒精），冰醋酸5ml，福尔马林5ml。2、卡尔诺氏（Carnoys）固定液：多用于组织和细胞的固定，渗透力极快，一般情况下，固定根尖和花药只需40-60分钟。固定后用95%酒精冲洗，在组织不能立即处理时，需转入70酒精中保存。配方1：15ml乙醇和5ml冰醋酸混合；配方2：30ml乙醇，5ml氯仿和1ml冰醋酸混合。3、纳瓦兴（Navaschjns）固定液：植物制片技术中广泛应用。配方：75ml1%铬酸，5ml冰醋酸和20ml福尔马林混合。根据实验材料的种类，目前有很多的改良液，效果更好。,材料脱水,材料洗涤后，如果材料含有水分，水与石蜡不能相溶，通常用酒精脱水。材料由水入酒精中，由低浓度酒精渐至高浓度酒精。通常由30%、50%、70%、80%到90%酒精，每次须经半小时左右，具体的时间由材料大小而定。材料可放在70酒精中较长保存，但在高浓度酒精中不能过久。因为酒精能使材料硬化，过久则材料由硬而脆，切片时易于粉碎。,材料透明,材料脱水后，仍需除去酒精，脱酒精通常用二甲苯。材料由酒精入二甲苯，也需要渐次进行，先经酒精和二甲苯的混合液，再入纯二甲苯中，纯二甲苯须换一、二次才行。时间每次约半小时。二甲苯不仅脱去酒精，并且具透明作用，所以又叫透明剂。,材料包埋,埋蜡是把材料包埋在石蜡里面，便于切片。石蜡质地必须纯净，溶点通常在48-56范围内，以52的石蜡使用更为方便。将石蜡置陶瓷钵中加热熔化；在进行封埋的全过程中，石蜡的温度以高于溶点2为宜，温度低则石蜡凝固，温度过高则伤害实验材料。在包埋之前需要对实验材料进行浸蜡。浸蜡需要渐次进行。一般先用石蜡和二甲苯的混合液浸蜡，再用纯石蜡换1-2次，每次时间视材料大小而定，通常每次半小时。,二、制片（12月3日）,切片：1.先将蜡块切成小块，粘固在小木头桩上。2.安装切片刀，调好角度和切口部位。3.根据需要调整切片厚度，进行切片。展片：将切好的石蜡材料平展在玻片上，一般借助水将石蜡切片展开。粘片：通过加热使切好蜡带平展在载玻片上。用滤纸吸去载玻片上多余水分，同时以记号笔在玻片上编号以确定材料方位，放入42温箱中烘干，约12小时。,粘片（载玻片的处理）,多数采用多聚赖氨酸作为粘贴剂，多聚赖氨酸常用PBS配制。方法：用之前将稀释的多聚赖氨酸溶液放在室内，使其温度回升至室温（一般为18-26）。将玻片浸在稀释的多聚赖氨酸溶液中5-30分钟。然后在60烘箱干燥1小时，或室温18-26过夜干燥，待用。,三、探针制备,RNA探针是指带有标记的能与组织内相对应的核苷酸序列互补结合的一段单链cDNA或cRNA分子。根据在RNA杂交中所使用的探针依其来源可分为三种：1、特异性cDNA：cDNA中不存在内含子及其它高度重复序列，又克服了双链cDNA探针在杂交反应中两条链之间复性的缺点，从而提高了杂交反应的敏感性2、cRNA探针：以cDNA为模板，通过体外转录而获得的。因为它是一种单链探针，因此也避免了应用双链cDNA探针做杂交反应时存在的两条链之间的复性问题。cRNA与RNA之间形成的杂交体要比cDNA-RNA杂交体稳定。cRNA-RNA之间形成的杂交体不受RNA酶的影响。因此杂交反应后可用RNA酶处理，以除去未结合的探针。3、人工合成寡核苷酸探针：人工合成的寡核苷探针是以核苷酸为原料，通过DNA合成仪合成，避免了真核细胞中存在的高度重复序列带来的不利影响。它与mRNA形成的杂交体不如cRNA-RNA杂交体稳定，再则探针较短，所携带的标记物少，敏感性较低。,探针标记,同位素标记探针和非同位素标记探针1、同位素标记：主要包括3H、35C、32P和125I等，不同的同位素探针其穿透力、定位和半衰期各不相同，无一种同位素探针具有穿透力强、定位好和半衰期长所有优点。2、非同位素标记;标记物主要有生物素、地高辛、酶和荧光标记等。其中地高辛标记的cDNA、RNA和寡核苷酸探针，不但具有生物素标记优点，还克服了生物素标记的探针在原位杂交过程中受组织内源性生物素干扰等缺点，其应用越来越广泛。,标记探针的方法,酶反应法：用于RNA探针的酶反应法主要为末端标记法与体外转录法。1、末端标记：适用于合成寡核苷酸探针的标记，用末端标记制备的探针一般携带的标记分子较少。2、体外转录法是一种制备与片段序列相同的单链RNA探针的方法。进行体外转录时，先将靶核苷酸序列转入到含噬菌体转录启动子的载体中，然后在RNA聚合酶的作用下，以DNA为模板，以含有标记的三磷酸苷为原料，对启动子下游的序列进行转录，而启动子本身并不被转录。,体外转录法制备探针,体外转录常用噬菌体转录启动子，如沙门氏菌噬菌体和大肠杆菌噬菌体T3、T7。当两个不同的噬菌体转录启动子结合在载体多位点的两侧，用适当的限制性内切酶在插入序列的下游将质粒线性化。SP6噬菌体的RNA聚合酶对SP6启动子序列具有高度的亲和性，从而启动下游的转录，在4种三磷酸核糖核苷和相应的噬菌体RNA聚合酶存在的条件下，即转录成RNA。如反应物中含有标记的三磷酸核糖苷核，所有的RNA就被标记。,体外转录法中常使用的载体,mRNA杂交探针（体外转录）,T7promoter,通过限制性内切酶的酶切控制体外转录合成探针的长度！,体外转录制备探针的步骤,1、将目的基因的特异性片段构建在合适的载体中；2、通过限制性酶切控制转录合成探针的大小；3、体外转录（同时标记探针）,地高辛标记的体外转录（12月3日）,1、按照下表将各成分加入EP管中，混匀后在37保温2小时；,2、加入2l无RNase的DNaseI，37保温15分钟；,3、加入2l0.2mol/LEDTA终止反应；,4、加入2.5l4mol/LLiCl和75l冰冷的100%乙醇，沉淀过夜；,5、12000rpm，4离心15分钟。用70%冷乙醇清洗后在室温下进行干燥。,6、根据沉淀物的多少（一般为6-10g），重悬于30-50lDEPC-H2O中，并加入20URNase抑制剂，-20保存。,四、预杂交（12月4日上午）,1将已粘片的石蜡切片在二甲苯中脱蜡30分钟。2在二甲苯：乙醇（1:1）、100%乙醇、95%乙醇、70%乙醇、30%乙醇和DEPC-H20中复水，每级2-5分钟。3在0.2mol/LHCl中浸20分钟。4在2SSPE中洗2次，DEPC-H2O中洗2次，每次5分钟。5在含有1%牛血清白蛋白的10mmol/LTris-HCl（pH8）中浸10分钟。6DEPC-H2O中洗2次，每次5分钟。7经30%，70%，95%，100%乙醇系列脱水，每次2-5分钟，室温晾干。,五、杂交（12月4日）,1、将转录物用稀释液（50%甲酰胺，10mM二硫苏糖醇（DTT），用DEPC-H2O定容）稀释。2、70加热5分钟，再加入杂交缓冲液。3、每玻片上加杂交液100l，轻轻盖上经180烘烤8小时以上的盖玻片。4、在湿盒中60保温过夜。（约12-16小时）,杂交缓冲液配方,10盐：3mol/LNaCl，0.1mol/LTris-HCl（pH6.8），0.1mol/LNa2HPO4，50mmol/LEDTA，溶于DEPC-H2O。,六、杂交后处理（12月5日上午）,1、让盖玻片在2SSC中自由滑落，室温浸泡15分钟。2、转入另一2SSC中浸泡15分钟。3、1SSC中15分钟。4、0.5SSC中15分钟。,七、免疫反应（12月5上午）,1、在缓冲液I（100mmol/LTris-HCl，150mmol/LNaCl，pH7.5）中5分钟。2、每片滴加约500l含2%正常兔血清，0.3%TritonX-100的缓冲液I，室温放置30分钟，作封阻反应。3、将anti-DIG-AP按1:500的比例用含1正常兔血清，0.15%TritonX-100的缓冲液稀释。4、倒掉封阻液，每片滴加100l稀释的anti-DIG-AP，室温条件下，在湿盒中放置2-4小时。,八、显色反应（12月5日下午）,1、玻片在缓冲液I中浸2次，每次15分钟。2、缓冲液II（100mmol/LTris-HCl，100mmol/LNaCl，50mmol/LMgCl2，pH9.5）中5分钟。3、将10%聚乙烯醇（PVA）90溶于100mmol/LTris-HCl（pH9.5），100mmol/LNaCl中，冷却至室温后，每mlPVA溶液中加50l1mol/LMgCl2，5l氮蓝四唑（NBT），3.75l5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸（BCIP）配成显色液。4、每片滴加200l显色液，置湿盒中37黑暗处显色6-12小时。,九、封片观察（12月6日）,1、将载玻片转入缓冲液