小鼠骨髓微核试验

小鼠骨髓细胞微核试验一、目的与要求1. 熟悉微核的概念、微核的来源、体内微核试验的实验设计、微核试验检测的遗传学终点。2. 学习和掌握小鼠骨髓细胞微核试验基本方法步骤，嗜多染红细胞及微核细胞镜下观察。3. 了解微核试验数据整理、分析方法及结果的评价。二、实验原理微核与染色体损伤有关，是染色体或染色单体的无着丝点断片或纺锤丝受损伤而丢失的整个染色体，在细胞分裂后期遗留在细胞质中，末期之后，单独形成一个或几个规则的次核，包含在子细胞的胞质内，因比主核小，故称微核。无论是断片还是整条染色体，其实质都是遗传物质，一但发生畸变，就有能形成遗传物质方面的问题，造成突变，因此，微核的检测实质上就是遗传物质突变的检测，现已被卫生部定为外来化合物毒理检测的个必检指标。微核试验是观察受试物能否产生微核的试验。主要可检出DNA断裂剂和非整倍体诱变剂。传统的微核试验是体内试验，它观察骨髓嗜多染红细胞（PCE）中的微核。微核可位于多种细胞，但在有核细胞中难与正常核的分叶及核突出物区分，所以只有在无核的红细胞中才易辨认。在骨髓中无核的红细胞有嗜多染红细胞或称晚幼红细胞（呈灰蓝或浅蓝色）和成熟红细胞（呈粉红或桔红色）两种，正常情况下嗜多染红细胞占多数，所以观察骨髓嗜多染红细胞。PCE指在红细胞成熟之前，最后一次分离后数小时将主核排出而微核仍保留在细胞质中的细胞，但由于嗜多染红细胞的胞质内含有核糖体，因此Giemsa染色呈灰蓝色，成熟红细胞的核糖体已消失，被染成淡橘红色，使嗜多染红细胞在染色上与正常RBC（NCE）有所不同。微核可以由染色体诱裂剂导致的染色体无着丝粒片段所构成，也可以由非整倍体诱发剂所导致的落后染色体形成。三、实验设计1. 动物选择：常用小鼠，体重1820 g，712周龄，每组10只，雌雄各半。2. 染毒途径：原则上与人接触化学毒物相同或相近的途径。3. 染毒次数及取样时间：一般采用两次染毒或多次染毒。两次染毒：第1次染毒后24小时进行第2次染毒，6小时后取样；多次染毒：每天染毒1次，连续染毒5天，末次染毒后24小时取样。4. 剂量选择：至少设置3个剂量组。高剂量组应达到不产生动物死亡的最大毒作用剂量。一般取受试样品1/5、1/10、1/20 LD50剂量。当受试样品的LD50大于5 g/kg时，可取5 g/kg为最高剂量，以下设35个剂量组。另设溶剂对照组（阴性对照组）和阳性对照组。阳性对照组可用环磷酰胺（50100 mg/kg）或丝裂霉素C（10 mg/kg）腹腔注射1次。四、操作步骤1. 骨髓液的制备及涂片颈椎脱臼处死小鼠，取胸骨，擦净血污，剔去肌肉，剪去骨骺，将骨髓挤于有一滴小牛血清的清洁载玻片一端，另取一块边缘整齐的载玻片，在血清上轻轻按摩，使骨髓完全混匀，然后以4550度角快速推片，推片后在空气中晾干。2. 固定将推好晾干的骨髓片用甲醇溶液固定15分钟，晾干。3. 染色将固定晾干后的涂片用新鲜配制的Giemsa应用液染色1015分钟，然后用缓冲液冲洗掉玻片上的染色液，晾干。4. 观察计数先在低倍镜下进行观察，选择分布均匀，染色较好的区域，再在油镜下观察计数。嗜多染红细胞（PCE）通常为灰蓝色，一般被形容成多云的天空。正染红细胞（NCE）通常呈淡黄、橘黄等鲜艳明亮的颜色。微核多呈圆形，边缘光滑整齐，直径相当于细胞直径的1/201/5，染色与核质一致，呈紫红色或蓝紫色。一个细胞内可出现一个或多个微核。计数1000个PCE中含微核的PCE数（嗜多染红细胞中出现两个或更多个微核，仍按一个微核细胞计算），并且计数200个细胞中PCE与NCE的比值。五、结果分析及评价微核率以千分率表示。每只动物为一观察单位。每组的雌、雄动物分别计算微核PCE的均值及标准差。雌、雄动物之间无明显的性别差异时可合并计算结果。正常的PCE/NCE比值约为1（正常范围为0.61.2）。如比值0.1，则表示PCE形成受到严重抑制