阿魏酸酯酶的研究与应用.ppt

阿魏酸酯酶的研究与应用,随着全球人口和经济规模的不断增长，能源使用带来的环境问题及其诱因不断地为人们所认识，不止是烟雾、光化学烟雾和酸雨等的危害，大气中二氧化碳浓度升高将带来的全球气候变化，也已被确认为不争的事实。二氧化碳的释放很大部分是由于植物秸秆的燃烧。这不尽污染了环境而且也是对能源的浪费。,图一：中国主要粮食作物年平均秸秆燃烧情况,3.96108t,0.94108t,图二：粮食作物秸秆露天焚烧排放情况,纤维素是世界上最丰富的天然有机物，占植物界碳含量的50以上。,图三：一般木材中的成分,此外，麻、麦秆、稻草、甘蔗渣等，都是纤维素的丰富来源。,所以，应如何充分利用秸秆，木材等生物原料？,分解纤维素的酶：纤维素酶、木聚糖酶、阿拉伯糖苷酶、阿魏酸酯酶,什么是阿魏酸酯酶？,一：阿魏酸酯酶feruloylesterase,阿魏酸酯酶指能水解阿魏酸甲酯、低聚糖阿魏酸酯和多糖阿魏酸酯中的酯键，将阿魏酸游离出来的一种酶。它能切断细胞壁中多糖-多糖、多糖-木质素间的交联，有利于细胞壁物质中多糖的降解和木质素的释放，因此在食品、饲料和造纸工业具有广阔的应用前景。,阿魏酸酯酶A的三维结构,阿魏酸,阿魏酸(FerulicAcid)的化学名称为4羟基3甲氧基肉桂酸，是植物界普遍存在的一种酚酸,在植物体内很少以游离态存在,主要与细胞壁多糖和木质素交联构成细胞壁的一部分，与低聚糖、多胺、脂类和多糖形成结合态。它有许多保健功能,如清除自由基、抗血栓、抗菌消炎、抑制肿瘤、防治高血压、心脏病等。阿魏酸毒性低,易于为人体代谢,其用途越来越广泛。阿魏酸在食品工业中主要用于制备天然香兰素、抗氧化剂、防腐剂、交联剂和机能促进剂等,阿魏酸可通过化学合成法和提取法获得。,阿魏酸分子式,目录：一、阿魏酸酯酶feruloylesterase二、阿魏酸酯酶对其它纤维素酶类具有协同作用三、阿魏酸酯酶的结构以及催化特性四、阿魏酸酯酶的分类和催化专一性五、阿魏酸酯酶的最适作用条件六、阿魏酸酯酶的应用七、黑曲霉阿魏酸酯酶A的克隆、表达及快速酶活检测体系的建立八、阿魏酸酯酶的研究现状及展望,二、阿魏酸酯酶对其它纤维素酶类具有协同作用,例1：当阿魏酸酯酶加入量为240mu/g对底物水解72h时,稻草纤维素的酶解率、不溶性底物失重率较不加阿魏酸酯酶分别增加了32.00%、32.77%；阿魏酸酯酶(300mu/g)对底物作用120min后，纤维素酶对稻草纤维素的酶解率、不溶性底物失重率分别增加了29.85%、32.48%。由此表明,阿魏酸酯酶和纤维素酶之间存在较大的协同作用，添加阿魏酸酯酶能够提高纤维素酶对天然木质纤维素的酶解效率。,例2：在pH值为5.0、45、料液比130（gmL）条件下，取47.5U/mL的木聚糖酶粗酶液15mL，加入1.0g麦糟的乙醇不溶物，反应12h后，加入40.8U/mL的阿魏酸酯酶粗酶液15mL再反应12h，阿魏酸和低聚木糖释放率分别为54.1%和161mg/g（麦糟的乙醇不溶物）。结果表明，阿魏酸酯酶与木聚糖酶存在协同作用，能极大提高麦糟中阿魏酸及低聚木糖的释放率，有利于麦糟的降解。,三、阿魏酸酯酶的结构以及催化特性,由于其催化底物的结构复杂，相应的阿魏酸酯酶也有着相当复杂的结构。虽然不同的阿魏酸酯酶结构有差异，但都为球蛋白质且大都具有Ser-His-Asp的“三点催化活性中心”仅结核分枝杆菌(Mycobacteriumtu-berculosis)产生的酶的活性中心由Ser-Glu-His组成。阿魏酸酯酶A氨基酸序列：MKISAPRALALSVAVGHALAAVTKGVSDNIYNRLVDMATISQAAYADLCKIPATITTVEKIYNAQTDINGWVLRDDSRQEIIVVFRGTAGDTNLQLDTNYTLAPFDTLPKCIGCAVHGGYYLGWTSVQDQVESLVQQQAGQYPEYALTVTGHSLGASMAAITASQLSATYEHVTLYTFGEPRTGNLAYASYMNENFEATSPETTRFFRVTHGNDGIPNLPPAEQGYVHSGIEYWSVDPHRPGSTSVCTGNEVQCCEAQGGQGVNDDHITYFGMASGACSW-,MKQFSAKYALILLATAGQALAASTQGISEDLYNRLVEMATISQAAYADLCNIPSTIIKGEKIYNAQTDINGWILRDDTSKEIITVFRGTGSDTNLQLDTNYTLTPFDTLPQCNDCEVHGGYYIGWISVQDQVESLVKQQASQYPDYALTVTGHSLGASMAALTAAQLSATYDNVRLYTFGEPRSGNQAFASYMNDAFQVSSPETTQYFRVTHSNDGIPNLPPADEGYAHGGVEYWSVDPYSAQNTFVCTGDEVQCCEAQGGQGVNDAHTTYFGMTSGACTW,催化过程中阿魏酸酯酶的催化中心和辅助中心将阿魏酸酯化合物中的阿魏酸残基束缚，而后经过一系列化学过程将酯键断裂,使阿魏酸游离出来。,四、阿魏酸酯酶的分类和催化专一性,阿魏酸酯酶对苯乙酸酯类具有催化专一性,然而不同的阿魏酸酯酶的催化专一性也有所不同,依据催化专一性的不同,阿魏酸酯酶最初被分为A、B两种类型,后来又发现了一些其他类型。,A型这一类阿魏酸酯酶对以1,5-酯键连接在阿拉伯糖残基C-5上的阿魏酸具有催化专一性。当原料用木聚糖酶预处理过或用木聚糖酶与阿魏酸酯酶协同水解时,产物中有少量的5,5-和8-O-4-阿魏酸二聚体。A型的阿魏酸酯酶对苯环上有甲氧基(特别是在3,5位)的酚类酯都有催化特性。A型阿魏酸酯酶还可以催化水解人工合成的阿魏酸甲酯、芥子酸甲酯以及香兰酸甲酯中的酯键,但是对咖啡酸甲酯无效。AnFaeA就是属于A型的阿魏酸酯酶。当以谷物作为培养基时,微生物倾向于产生A型阿魏酸酯酶。,B型以甜菜渣做培养基时,微生物倾向于分泌B型阿魏酸酯酶。B型的阿魏酸酯酶对连接在阿拉伯糖残基C-2和半乳糖残基C-6上的阿魏酸酯键具有专一性,黑曲霉来源的B型阿魏酸酯酶对1,5-阿魏酸阿拉伯糖酯键也有催化作用,但效果远远低于A型。另外B型的阿魏酸酯酶不能使阿魏酸二聚体游离出来。B型阿魏酸酯酶还可以催化水解人工合成的阿魏酸甲酯、咖啡酸甲酯以及香兰酸甲酯中的酯键,但是对芥子酸甲酯无效。B型阿魏酸酯酶的产酶微生物主要有黑曲霉、青霉和链孢霉菌等。,第三种类型目前还发现一种称作XYLD的乙酸酯酶具有阿魏酸酯酶活性,它是从荧光假单胞杆菌的一个亚种中分离得到的,它对苯乙烯酚酸酯类(阿魏酸酯、咖啡酸酯、香兰酸酯以及芥子酸酯)的化合物同样有催化作用。用XYLD处理小麦的外壳,产物中有5,5-阿魏酸二聚体。此外,也有研究者依据诱导产酶培养基、能水解的酯键、肽链中氨基酸的序列和产物中是否产生阿魏酸的二聚体等因素进一步把阿魏酸酯酶细分为A、B、C、D4类。,Table1Classificationofferuloylesterases,菌株名称,黑曲霉Aspergillusniger,产黄青霉Penicilliumchrysogenum,绳状青霉Penicilliumfuniculosum,荧光假单胞菌Pseudomonasfluorescens,粗糙脉孢菌Neurosporacrassa,互隔交链孢菌Alternariaalternata,甘蓝链格孢菌Alternariabrassicicola,阿魏酸酯酶的名称,Type-AferuloylesterasefromPenicilliumchrysogenum,Type-BferuloylesterasefromPenicilliumchrysogenum,Type-CferuloylesterasefromPenicilliumchrysogenum,Type-AferuloylesterasefromAspergillusniger,Type-BferuloylesterasefromAspergillusNiger,Type-CferuloylesterasefromSporotrichumthermosporum,PcFacC,PcFacB,StFaeC,AnFaeB,PcFacA,AnFaeA,五、阿魏酸酯酶的最适作用条件,阿魏酸酯酶种类不同,其作用的最适条件也不尽相同。表1列出了典型的产酶微生物黑曲霉所产生的几种阿魏酸酯酶的最适作用条件。,例：方园等人利用泡盛曲霉固体发酵麦麸，蔗渣等纤维质原料产生阿魏酸酯酶，并对其酶学性质进行初步检验，结果表明：该酶制剂最适pH为6.0，最适温度为25，Cu2+、Fe2+、EDTA对该酶活力有激活作用，Mg2+、Zn2+、Mn2+则有一定的抑制作用。其中，Cu2+的最适添加浓度为0.25mol/L，EDTA与Fe2+的最适添加浓度为0.20mol/L。W(最适酶):W(底物)=1:100，在1.5h后，酶解产率达到最高。并研究该酶对去淀粉麦麸、蔗渣、玉米皮和玉米芯这4种天然纤维质原料的酶解效果，结果表明该酶对去淀粉麦麸的酶解效果最佳。产生阿魏酸的质量浓度达到72.93mg/L。,六、阿魏酸酯酶的应用,1.在食品工业中的应用研究表明阿魏酸可以作为抗氧化剂用于油脂的抗氧化,除此之外,阿魏酸还具有的抗肿瘤、消炎、促进伤口愈合等保健作用,所以阿魏酸可作为功能因子开发功能性的食品。同时,阿魏酸可以作为合成天然香兰素的前体,以阿魏酸为原料,利用微生物的方法生产的香兰素与合成的香兰素相比具有毒性低,安全性高的特点,可以用作食品和化妆品行业的香料。阿魏酸大量存在于植物的细胞壁中,研究者使用阿魏酸酯酶和使用阿魏酸酯酶与其他酶协同作用从各种农作物的副产品中提取阿魏酸的研究取得了一定的成果,目前主要使用麦麸、玉米麸皮等作为原材料来提取阿魏酸。,2.在饲料和造纸工业中的应用利用阿魏酸酯酶处理植物性的原材料,可以将阿魏酸从植物细胞壁的结构中游离出来,从而破坏了细胞壁的骨架结构,使得木质素、半纤维素以及纤维素之间的连接被部分打破,结构变得比处理前疏松。在饲料工业中,变得疏松的原料更容易被牲畜消化吸收利用,可以提高饲料的利用效率。而在造纸工业中,纤维素是构成纸张的主要成分,半纤维素可部分被利用,木质素是需要去除的成分,经阿魏酸酯酶处理的原料,木质素更容易脱除,因而可以减少制浆工序的化学药品用量。而纤维细胞壁经阿魏酸酯处理后,表面变得疏松,更容易形成分叉,在成纸时,纤维间的交织力变大,可以提高纸品的机械强度。,七、黑曲霉阿魏酸酯酶A的克隆、表达及快速酶活检测体系的建立,黑曲霉在PDA固体培养基上划线活化,挑取黑曲霉孢子接种于50mL黑曲霉液体基本培养基中,收集菌体,以CTAB法提取总RNA,以总RNA为模板，以oligo(dT)为引物逆转录合成第一链cDNA.,以第一链cDNA为模板进行PCR扩增出编码阿魏酸酯酶的cDNA,经胶回收纯化的PCR产物连接到pMD18-T克隆载体上后转化E.coliDH5感受态细胞。,7.1.黑曲霉阿魏酸酯酶AcDNA的获得,培养5d,培养24h,7.2.表达载体的构建、阳性克隆的筛选和表达,以正确的质粒为模板扩增无信号肽的成熟阿魏酸酯酶编码序列,产物经胶回收后用EcoRI和NotI限制性内切酶进行双酶切,连接到pPIC9K上相应的多克隆位点,用限制性内切酶BglII酶切pPIC9K/NS-faeA,回收目的片段,用电击法转化感受态毕赤酵母GS115.,将转化的毕赤酵母涂布于MD琼脂平板上,培养2d,挑取单菌落,在BMGY中培养1d,离心收集菌体,提取其基因组DNA,进行PCR验证质粒转化情况,挑取质粒转化成功的阳性菌落，在BMGY培养基中培养2d（30、200rmp),离心收集的菌体重悬于10mLBMMY培养基,同样条件继续培养3d，每天补加50L的甲醇,7.3酶活的快速检测,反应体系为1mL，其组成为：100L体积10mmol/L的阿魏酸对硝基苯酚酯的DSMO溶液，800L含有2.5%(V/V)的TritonX-100的0.1mol/L磷酸钠缓冲液(pH6.4)和100L的酶溶液。在40反应30min后于410nm波长处测定阿魏酸对硝基苯酚酯降解生成对硝基苯酚的吸光度，并计算出生成对硝基苯酚的浓度。,7.4部分实验步骤：,1、PCR扩增：（小试，共20L）ddH2O14.4L72L10PCRbuffer2L10L引物1（10M）1L5L引物2（10M）1L55L混匀分装19L/管5管dNTP（10mM）0.4L2L模板（原液40稀释）1LTaq酶0.2L1L按顺序加入上述物质，最后加入Taq酶PCR反应程序945min9430sTm30s26个循环721min7210min4保存以上PCR产物跑琼脂糖凝胶（0.8%）,2、PCR扩增：（大试，共200L）ddH2O144L10PCRbuffer20L引物1（10M）10L引物2（10M）10L混匀分装40L/管5管dNTP（10mM）4L模板10LTaq酶2L按顺序加入上述物质，最后加入Taq酶PCR反应程序945min9430sTm30s30个循环721min7210min4保存以上PCR产物跑琼脂糖凝胶（0.8%）,八、阿魏酸酯酶的研究现状及展望,到目前为止,阿魏酸酯酶的研究上已进行了一些卓有成效的工作。首先,筛选了一批能高效分泌阿魏酸酯酶